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RNA的提取纯化 ＲＮＡ酶活性的控制 为了获得高质量的真核细胞mＲＮＡ，必须使用ＲＮＡ酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活ＲＮ Ａ酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的ＲＮＡ酶的活性。同时，避免偶然引入实 验室内其他潜在的痕量ＲＮＡ酶也很重要。下面列举避免ＲＮＡ酶法染问题的一些注意事项。大多数有经 验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。 实验程序 ＲＮＡ酶的抑制剂 破碎细胞和灭活ＲＮＡ酶同步进行的方法 （一）实验程序 如不谨慎操作，外源性ＲＮＡ酶可以通过下述途径污染ＲＮＡ制品： （１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无ＲＮＡ酶，可以不经预处理直 接用于制备和贮存ＲＮＡ。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有ＲＮＡ酶法染，使用前必须于180℃ 干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（Ｄ ＥＰＣ）的水溶液浸泡用于制备ＲＮＡ的烧杯，试管和其他用品。ＤＥＰＣ是ＲＮＡ酶的强烈抑制剂，但 其作用并不是绝对的（Ｆedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满ＤＥＰＣ的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时， 然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Ｋumar和Ｌindberg,1972)。在15lbf/in2(1.034x105Pa) 高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的ＤＥＰＣ，以防ＤＥＰＣ通过羧甲基化作用对ＲＮ Ａ的嘌呤碱基进行修饰。 羧甲基化的ＲＮＡ在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其 形成ＤＮＡ：ＲＮＡ或ＲＮＡ：ＲＮＡ杂交休的能力并不明显降低。用于ＲＮＡ电泳的电泳槽应用去污剂 洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满３％的Ｈ２Ｏ２溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％Ｄ ＥＰＣ（见下文）处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标 记，存放在指定地点，为ＲＮＡ实验专用。 （２）研究人员造成的污染 ＲＮＡ酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析Ｒ ＮＡ的材料和溶液时，主有涉及ＲＮＡ的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和 其他物品以后，手套就可能沾染上ＲＮＡ酶，因此进行ＲＮＡ实验时应勤换手套。 （３）污染的溶液 用高压灭菌的水和ＲＮＡ研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将 溶液装入无ＲＮＡ酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％ＤＥＰＣ于37℃至少处理12小时，然后于 100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：ＤＥＰＣ可与胺类迅速发生 化学反应，因些不能用来处理含有Ｔris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Ｔris晶体以制备无ＲＮＡ 酶的溶液。返回 （二）ＲＮＡ酶的抑制剂 下面介绍３种广泛应用的特异性ＲＮＡ酶抑制剂。 （１）ＲＮＡ酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种ＲＮＡ酶紧密结合（KI≈3x1010） 形成非共价结合的等摩尔复合物，使ＲＮＡ酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成 素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰ＲＮＡ酶类似的一种血管生成因子，几个厂家以不同的商品名出售 这种抑制剂，该蛋白质应置于含５mmol/L二硫苏糖醇（ＤＴＴ）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制 service@100 service@100 wwwwww..110000bbiiootteecchh..ccoomm sseerrvviiccee@@110000bbiiootteecchh..ccoomm 品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的ＲＮ Ａ酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物细胞这一提取ＲＮＡ的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然 而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有ＲＮＡ纯化步骤中均应有此蛋白质存在。 由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂， 而且它并不干扰反转录或mＲＮＡ在无细胞体系中的翻译。 （２）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（ＩＶ）离子和４种核糖核苷之