XBP1调控胶质瘤细胞氧化应激的实验研究.pptVIP

* 基于这些设想，我们设计了一下实验 * 胎盘蓝技术检测h2o2处理细胞后细胞死亡情况，图中实线代表基因敲出细胞，虚线代表野生细胞，可见XBP1基因敲出细胞对H2O2的敏感性明显高于野生型细胞，在h2o2为1mM时ko细胞死亡50%，而wt细胞死亡10%左右，2mM时候，ko细胞几乎100%死亡，wt细胞死亡不足20%。 * 接下来我们用流式细胞技术检测线粒体膜电位，以此来反应细胞损伤，可见h2o2在KO细胞中诱导MMP下降更明显，LNAC可以抑制H2O2诱导的MMP下降。 * 上述实验结果显示XBP1基因缺失可以增强对氧化应激的敏感性，但是这种敏感性增强是否只局限在氧化应激，我们又用3种化疗药物进行验证，PTL是一阵活性氧诱导剂，处理细胞24h后，胎盘蓝检测细胞死亡，发现其结果与H2O2实验非常类似，KO细胞对PTL诱导的细胞死亡远远高于wt细胞。 * 接下来我们采用其它两种化疗药物VP16和FK228，结果发现，这两种药物诱导的细胞死亡在wt细胞和ko细胞没有明显区别。说明XBP1基因缺失引起的对氧化应激敏感为特异性的。 * 用流式细胞术检测MMP下降情况可见KO细胞PTL诱导的MMP下降更明显，LNAC明显抑制MMP下降 * XBP1基因缺失可以选择性增强细胞对ros的敏感性，这张增强作用是否伴随细胞内ros蓄积增高，因此我们检测了H2O2处理后细胞内ROS的蓄积情况，DCFHDA本身不具有荧光，但是可以被ROS氧化为具有荧光的DCFH，荧光强度值可以反应细胞内ros蓄积水平，蓝色峰代表对照细胞荧光强度，wt细胞与ko细胞没有明显区别，紫色曲线代表H2O2处理3h后荧光强度，可见wt细胞荧光强度上升3倍，而KO细胞上升超过6倍。右图为多次实验重复后的统计曲线，二者有明显差异。 * 接下来我们检测了ROS诱导的下游信号通路情况，h2o2作用好不同时间点检测细胞内P38和JNK的磷酸化水平，可见KO细胞JNK与P38磷酸化均明显延长，LNAC抑制p38的磷酸化，同样PTL诱导的P38磷酸化在KO细胞也被明显延长。 以上结果显示，加入同样剂量的外源性ros，在wt细胞和ko细胞可以出现不同水平的ros蓄积和ros下游通路的活化，提示可能在ko细胞ros清除系统存在障碍，因此我们检测了抗氧化分子的表达情况 * RT-PCR结果显示，相比wt细胞ko细胞的catalase、SOD1、TRX1表达均有不同程度下降，其中Catalase下降最明显，而GPx没有明显变化。 右图为real-time PCR结果，KO细胞内catalase水平为wt细胞的四分之一。 * 接下来我们又检测了H2O2对这些分子的表达是否有影响，结果发现h2o2诱导后Catalase、SOD1、TRX1均无变化，提示细胞基础水平的表达对就决定了细胞对H2O2的敏感性。 * Catalase在两种细胞中表达差异最明显，这种差异表达到底是不是细胞对h2o2敏感性的差别的原因，我们应用Catalase特异性抑制剂AT处理XBP1-wt细胞，然后观察细胞对h2o2敏感性是否会增强，结果发现AT可以明显增强h2o2诱导的细胞死亡，右图流式细胞术检测SubG1也发现有明显升高，weaternblot检测P38也可见P38可以被AT明显延长，提示Catalase的差异表达至少可以部分解释细胞敏感性的差异 * 进一步研究我们将两种类型的XBP1进行过表达，发现XBP1-u可以上调Catalase、sod1、TRX1，并且抑制H2O2诱导的ROS蓄积，而XBP1-s没有类似功能。说明XBP1上调Catalase发挥抗氧化应激作用是通过XBP1-u实现的。 * XBP1是否果真可以提高catalase转录，它的作用位点又在什么地方，我们用luciferase活性分析来进行检测，将携带catalase启动子序列不同片段的荧光素酶报告质粒和XBP1-u进行共同转染，如果XBP1可以促进catalase转录，那么catalase启动子活性会升高，由于luciferase报告系统在catalase启动子后连接后荧光素酶基因，启动子的活性越高荧光素酶表达越强，通过荧光素酶活性检测可以反应启动子活性。结果显示，XBP1增强catalase的转录作用主要发生在-191/68区间，而-1394/-191区间可能存在一些负性调节因子的结合位点，抵消了XBP1的增强作用。 * 进一步分析，-191/68区间调控转录的序列主要有GCbox，CCAATbox，我们将这几个位点进行突变，然后进行荧光素酶活性分析，发现GCbox突变后XBP1促进catalase转录的作用只有微弱变化，而CCAATbox2突变可以显著下降XBP1的作用，CCAAT2、3共同突变后XBP1的作用完全消失，说明XBP1上调cata