第五章 工业微生物基因育种.pptVIP

第五章  工业微生物基因育种 目的与要求 了解和掌握基因工程育种的原理与方法； 了解基因工程的主要载体与基因定位诱变的原理与方法。 教学重点：质粒的特性与基因工程操作原理 教学难点：基因定位诱变的原理 教学内容 1、概述 基因工程在微生物育种中的地位和作用，原理 2、基因工程载体 几种常见的载体 3、基因工程所用的酶 限制性内切酶，核酸酶，连接酶，聚合酶等 4、基因工程的主要步骤 5、基因定位诱变 The transforming principle is DNA. 基因工程流程示意图 3,改良工业酶生产菌株:蛋白酶,木糖异构酶,纤维素酶,葡萄糖淀粉酶以及凝乳酶等均进行了研究.研究较多的是α-淀粉酶和青霉素酰化酶. 1981年起,在枯草杆菌或大肠杆菌中克隆和表达了来自枯草杆菌,淀粉液化芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等菌种的α-淀粉酶基因,比野生株最高的可达30倍.目前美国已用基因工程菌生产. 德国首先克隆大肠杆菌青霉素G酰化酶基因.我国青霉素G酰化酶的产量可达3000单位/L以上. 三、基因工程原理和步骤 一),目的基因的取得:①选择适宜的给体细胞,从中采集分离有生产意义的目的基因;②通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA);③用化学方法合成特定功能的基因. 二),选择载体: 原核受体细胞的载体,主要是细菌质粒(松弛型)和λ噬菌体.动物细胞,主要是SV40病毒.植物细胞主要是TI质粒 三),目的基因与载体DNA的体外重组:采用限制性内切酶处理目的基因与载体DNA,获得互补粘性末端或人工合成粘性末端.把两者放在较低的温度(5～6℃)下混合\退火\.由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段和粘性未端有相同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡粘性末端上碱基互补的片段,就会因氢键的作用而彼此吸引,重新形成双链,这时,在外加连接酶的作用下,供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被\缝合\,形成一个完整的有复制能力的环状重组体——嵌合体. 四),重组载体引入受体细胞: 微生物,动物或植物细胞.使用最广泛的是E.coli.其次为枯草杆菌和酿酒酵母.以重组质粒作载体,用转化方法; 以病毒DNA作重组载体,用感染方法. 理想情况,重组载体进入受体细胞,通过自主复制而大量扩增,使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状,受体细胞就成为工程菌. 四、基因工程载体 （二）、λ噬菌体载体 六、基因工程育种的主要步骤 DNA重组的 技术路线 以?噬菌体为载体进行DNA克隆 ?噬菌体感染大肠杆菌的途径 DNA重组体的筛选 pBR322质粒结构 原位杂交法筛选DNA重组体图解 Southern印迹法 Southern和Western印迹法 DNA重组技术的应用 核酸内切酶作用后的断裂方式 粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。 具有3’-OH（ Pst1 ），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。 Pst1 EcoR1 5’CTGCAG 3’ 5’GAATTC 3’ 3’GACGTC 5’ 3’CTTAAG 5’ 平末端 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。 同裂酶（isoschizomers) 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。 同尾酶（isocaudamer） 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A C CTAG G A CTAG T 限制性核酸内切酶的命名原则：