NGAL+mRNA荧光定量PCR检测方法建立及初步评价.pdfVIP

摘要 摘要 目的： associated 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase 被发现。近年来众多研究表明NGAL基因参与若干肿瘤的发生发展，可能是 人类的一种重要的癌基因；Goets等的研究还显示在细菌入侵机体后，NGAL 可以作为铁载体介导阻碍细菌对铁的捕获，从而抑制细菌的生长，是一种重要 的细菌抑制剂；NGAL还参与肾小管上皮发生的及功能调控，对急性肾损伤 (acute kidney 酐更为快速和准确，是AKI最强有力的预测因子。因此对NGAL基因的检测 亦显得尤为重要。本课题研究的目的就是建立NGALmRNA的荧光定量PCR (fluorescent quantitativePCR，FQ．PCR)检测方法，并将此方法应用于临床结 肠癌患者肿瘤组织、癌旁组织及正常组织NGALmRNA的检测，初步验证其应 用价值。 方法： 1．根据NGAL基因序列，设计并合成PCR引物，将PCR扩增的特异片段克 隆入T载体，重组质粒经筛选、鉴定、定量后作为标准品。 引物浓度、退火温度、SYBR green I染料(M92+)浓度等PCR反应条件进行 优化，从而建立NGALmRNA的检测方法。 3．将高浓度标准品质粒进行系列稀释，用上述优化的FQ—PCR方法进行检 测，以NGAL拷贝数为横坐标，循环阈值为纵坐标绘制标准曲线，用于被测物 的绝对定量。 4．对该检测方法进行敏感性、特异性及重复性等方法学评价。 5．将建立的FQ—PCR用于临床结肠癌患者肿瘤组织、癌旁组织及正常组织 NGALmRNA的检测，其结果与普通PCR相比较。 结果： 1．成功构建了重组质粒pGM—T-NGAL。 SYBR10xBuffer(with 2．确立了FQ—PCR最佳反应条件： M92+)2#1、 Il 摘要 dNTPs0．2mmol／L、上游、下游引物各0．32#mol／ml、SYBRTaqTM1．25#1、 ddH2015．15#1，退火温度60．O℃。 3．制作的标准曲线相关系数为98．9％，无非特异性扩增。建立了以NGAL mRNASYBR I染料技术为基础的实时荧光定量PCR方法，其线性检测范 green 性好； 4．对临床标木的检测结果与预期设想完全相符。肿瘤组织、癌旁组织正常组 织的NGALmRNA水平呈明显的下降梯度。与普通PCR相比，该检测方法灵敏 度要高约100倍。 结论： mRNA的定量标准品，其快速、 我们成功构建了FQ．PCR检测体系和NGAL 灵敏、特异的特点适合临床实验室的应用。为临床NGALmRNA的快速定量奠 定了坚实的基础。 关键词：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；SYBR I实时荧光定量PCR green Abstract ABSTRACT Ubjective： novelmemberof Neutrophilgelatinase-associatedlipocalinfNGAL)，a foundfrom etalin1993． lipocalinfamily,Was neutrophilgranulocyteby蜀eldsen