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分子信标的原理及应用 医学实验 05级 韩晓（主笔） 张旭 田野 王跃樊 摘要 在基因时代和蛋白质时代，人们迫切需要一种具有高灵敏度和高亲和力的生物分子探 针，用以进行定性和定量检测。分子信标技术的建立正是满足了人们的需求，因而这种技术 很快就广泛地应用于基础医学和生物学等诸多领域。分子信标作为一种荧光标记的分子探 针，具有极强的特异性和较高的灵敏度。本文介绍了分子信标的原理、影响分子信标的主要 因素、分子信标的标记和设计原则、新型分子信标以及分子信标的应用。 关键词 分子信标 分子信标的结构和原理 影响分子信标的主要因素 分子信标的标记 分 子信标的设计 波长移动分子信标 分子信标的基本应用 应用实例 正文 1996 年Tyagi和Kramer报道了一种具有发夹结构的新型荧光核酸探针——分子信标 (molecular beacon)，最初目的是能在液相中定量测定靶标的量。自由状态时的分子信标呈 发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子 信标的空间构型发生改变，荧光恢复。分子信标技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵 敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。在临床诊断、基因检测 等领域，分子信标也越来越显示出它的优势。 首先介绍分子信标的结构和原理。分子信标是一种荧 光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。在结构 上，分子信标大体上可以分为三部分（如图）：（1）环状 区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合； （2）茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶 分子结合过程中可发生可逆性解离；（3）荧光基团和淬灭 基团：荧光基团一般连接在5ˊ端，淬灭基团一般连接在3 ˊ端。 根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。自由状态时，分子信标呈发卡式结构， 1 从而荧光基团和淬灭基团相距较近（约7～10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基 团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当 分子信标与靶分子结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离加大，从而分子信标的荧光几乎 100%恢复。而且所检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比。 在影响分子信标的主要因素中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主 要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。另外， 温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在 较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和 淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的 长度、G-C含量和缓冲液的离子强度。Bonnet等研究温度对分子信标影响时发现，体系的荧 光强度呈现为一个先减弱后增强的过程。就此，Bonnet等做出如下解释： 如图，在较低温度下，分子信标与靶标结合呈S1状态，发出荧光。随着温度升高，分子 信标与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即S2状态，从而荧光强度减弱。温度持续 增高，将导致分子信标熔链即S3状态，荧光基团与淬灭基团分离，导致荧光恢复。其次，环 境、pH值也是影响分子信标的一个因素。pH值过高，分子信标的发卡结构可能被破坏，出现 假阳性结果。此外，分子信标的纯度，也将对分子信标产生影响。 分子信标通常都是修饰以一个单一的发光基团。在一个均相体系中，通过杂交后荧光信 号的