MK—EGFP融合蛋白的构建和表达.pdfVIP

· 342 · 浙江l临床医学 2010年4月第 l2卷第4期 · 基 础 研 究 · MK—EGFP融合蛋白的构建和表达 赵 宁 【摘要】 目的 克隆中期因子(midkine，MK)的编码序列，构建MK—EGFP融合表达质粒，诱导表达并亲合纯化。方法 用RT—PCR技术从人胚胎组织中获得 MK编码基因，构建原核表达质粒 pET—MK—EGFP；转化大肠杆菌，诱导表达重组 蛋白；纯化回收后鉴定生物活性。结果 重组质粒经酶切测序与预期相符，融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微 镜下清晰可见，MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性。结论 MK—EGFP重组质粒构建正确，融合蛋 白大量表达， 并具有完整的生物学活性。 【关键词】 中期因子(MK)增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 【Abstract】 Objective ToclonetheencodinggeneofMidkine．Toconstructthefusionexpressiveplasmid0fMidkineand EGFP，thentransform ittoE．coli．DI-I5c~forexpression．M ethods TheencodingsequenceofMKfrom humanfetalliverbyRT— PCR wasamplified．ThentheprokaryoticplasmidpET—MK —EGFPwasconstruct．Therecombinantplasmidwasexpressedinthe cellofEseherichiacolistrain(BL21)，thenitsbiologicalactivitieswasidentified．Results Th erecombinantplamidwasidentical asexpected．ThefusionproteinWaSexpressedinE．eoli(BL21，DE3)．Thegreenfluorescenceoftheproteincouldbeobservedby confocallasermicroscope．ItsstructureandbiologicalactivitiesbyWesternblotandNIH3T3celltestwereverified．Conclusion TheencodingsequenceofhumanMK genecanbesuccessfullyclonedintotheexpressivevectorandexpressedinE．coli．Thefusion proteinhasthecorrectbiologicalactivities． 【Keywords】 MidkineEnhancedgreenfluorescentprotein 中期因子(midkine，MK)是一种受视黄酸诱 室保存菌株 ；表达载体 pEGFP—N：及pET一28(a) 导的肝素结合生长因子，表达受发育调控 ，有时间 购 自Clontech公司；RNeasy抽提试剂盒与 QIA— 和空间限制性 。MK在妊娠中期时大量表达 ，而 quick凝胶 回收试剂盒及 Ni—NTAagarose购 自 在绝大多数正常成人的器官、组织中，则相当微 Qiagen公司；RT—PCR全套试剂购 自Promega公 弱 J。研究表明，MK可促进多种细胞的生长、存 司；核酸内切酶、DNA连接酶等选用 Roche公司产 活和迁移，在神经发生和器官发生过程 中的上皮 品；山羊抗人MK多克隆抗体、鼠抗山羊 IgG抗体购 一 间充质相互作用 中发挥作用，并在很多方面显 自SantaCruz公司。根据GenBank查得的MK成熟 示与肿瘤发生有关的活性 。本研究通过在体外 肽 cDNA编码序列，设计引物如下：Primer1(上游引 表达获得MK—EGFP融合蛋白，为下一步确定其 物)：5 一GGAATTCATGAAAAAGAAAGATAAGGT- 细胞定位及胞内相互蛋白