实验四蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳.docVIP

实验四 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18?，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。 由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表： SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 *丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD） 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 *双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。 1. SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制 ⑴ 试剂 ①丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。 小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。 ② 十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液保存于室温。 ③用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。 ④TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 ⑤过硫酸铵。 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须新鲜配制。 ⑥Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 ⑵ 装置： 使用不连续缓冲系统要求在垂直板凝胶上进行SDS聚丙烯酰胺电泳。 2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 ⑴ 根据厂家说明书安装玻璃板。 ⑵ 确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液 溶液成分 总体积 5ml 总体积 10ml 总体积 15ml 总体积 20ml 总体积 25ml 总体积 30ml 6% 水 2.6ml 5.3ml 7.9ml 10.6ml 13.2ml 15.9ml 30%丙烯酰胺 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml 5.0ml 6.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.004ml 0.008ml 0.012ml 0.016ml 0.02ml 0.024ml 8% 水 2.