窄叶菘蓝体细胞无性系根腐病抗性的RAPD分析.pdfVIP

江苏农业科学 2009年第 6期 窄叶菘蓝体细胞无性系根腐病抗性的RAPD分析 陈桂平 ，客绍英，陈玉芹 (唐山师范学院生命科学系，河北唐山063000) 摘要：在一定浓度根腐病菌粗毒素的胁迫下，对窄叶菘蓝体细胞无性系植株的根腐病抗性进行了筛选，初步获得 了具有表型抗性的植株。取同一个无性系的窄叶菘蓝植株及其亲本，提取其 DNA，经过检测后进行 RAPD分析。通 过对40个引物筛选和反应参数优化，选用2O个随机引物对DNA样品进行 RAPD扩增，12个获得较为清晰的扩增谱 带。对RAPD扩增结果的分析表明，无性系植株的遗传背景一致性很好，但也发生了DNA水平的变异，为进一步从分 子水平鉴定菘蓝抗性突变体和分离抗病基因提供理论依据。 关键词：菘蓝；根腐病；RAPD；无性系 中图分类号：$567．239．034 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2009)06—0060—02 菘蓝(0 tinctodavar．indigotica)是一种有重要开发前 1．4 RAPD扩增及 电泳分析 景的药用植物0，近年来，菘蓝在种植过程中常患根腐病，严 模板DNA2 l，0．4 moL／L引物 l l，10XPCR缓冲液2 重影响产量和品质。利用植物组织培养技术筛选抗病突变 l，2．5nmlo／／LdNTPs1．6 l，Taq酶0．5 l(1u)，SDW 12．9 体，一般将病原菌毒素加入培养基中作为选择因子，正向筛选 l。反应程序为94℃预变性5min；94oC变性 1min，34℃退 抗病细胞和植株 。本文运用 RAPD技术分析经一定浓度根 火 1min，72℃延伸 1min，35个循环 ；最后72℃延伸 10min。 腐病菌粗毒素处理的窄叶菘蓝亲本及无性系的基因组DNA， 反应完成后取 1O l扩增样品进行 1．2％琼脂糖凝胶电泳分 为进一步分离抗性基因和培育抗病品种打下基础。 析，在凝胶成像系统 (美国Bio—Red公司)上观察并照像。 1 材料与方法 2 结果与分析 1．1 试验材料 2．1 窄叶菘蓝幼苗性状分析 挑选饱满的窄叶菘蓝种子，流水浸泡3h。在超净工作台 所选无性系植株 Z16共7株，编号为0、1、2、3、4、5、6。0 上无菌水冲洗 3～4次，70％乙醇表面消毒 30s，0．1％氧化汞 号为亲本，其他来源于0号种子。对菘蓝幼苗进行外部性状 消毒 6～12rain，无菌水冲洗 4次，接种于 1／2MS培养基。 及生长状况观察显示：亲本 0号性状为 7片叶，生长状况 良 5～7d幼苗长至4～5cm时，切取下胚轴，转接入继代培养基 好；生长状况最好的是 5、6号，2个植株的形状差异不明显， 中促芽；将幼芽接入MS培养基中留作亲本。21d继代 1次， 生长的叶片分别为12片与 1O片，株高相同；2号植株稍逊于 4次后壮苗21d，然后接入含有一定浓度根腐病粗毒素的生 5、6号，具有 1O片叶，株高与前者相同但叶片发黄；1号植株 根培养基，待植株表型出现差异后 (约 20d)即可选取 1个无 稍逊于 2号，具有8片叶，叶片发黄；3、4号情况基本相同，生 性系及其亲本植株的根作为试验材料 。最后选取来 自同一颗 长状况最差，分别只有 5片和6片叶，且叶片发黄程度较高， 种子，经过 l0。个／ml的孢子菌悬液所对应的粗毒素侵染过 有些叶片已发生萎蔫。总体趋势为：5号、6号2号1号 的无性系Z16的苗 (由第 16颗种子 繁殖成的无 性系)作 0号 3号 、4号。 RAPD分析。 2．2 窄叶菘蓝幼苗 DNA的提取及分析 根腐病菌由患根腐病的菘蓝植株的根部分离获得，经初 按改 良的SDS法对菘蓝嫩叶DNA进行抽提，经0．8％琼 步鉴定属半知菌亚门尖孢镰刀菌属。