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内源性硫化氢合成酶参与新生期母爱剥夺诱导成年大鼠内脏过敏的外周机制研究 中文摘要 中文摘要 目的 1. 初步阐明新生期母爱剥夺(Neonatal Maternal Deprivation, NMD)诱导的成 年大鼠内脏痛过敏中脊髓背根节神经元上电压门控性钠通道表达和功能的变化特征。 2. 探讨内源性硫化氢合酶胱硫醚--合成酶（CBS ）在慢性内脏痛中的作用及 其对电压门控性钠通道表达和功能调控的影响。 方法 1. 新生鼠从出生后第 2 天开始到第 15 天，处理组和母鼠分离，每天分开 3 个小时，对照组不做处理。运用这种方法诱导大鼠的内脏痛过敏模型。运用腹壁 撤回评分（AWR score ）方法评测NMD 大鼠的痛行为反应。腹腔注射CBS 阻断剂 羧甲基羟胺半盐酸（AOAA ），同样运用以上腹壁撤回评分方法评测大鼠的痛行为 反应，从而检测H S 在慢性痛模型中的作用。 2 2. 结肠管壁注射荧光素（DiI ）来标记肠特异性背根神经节 （DRG ）神经元， 运用全细胞膜片钳方法研究大鼠肠相关神经元兴奋性及电压依赖性钠通道电流的 变化特性。 3. 运用Western Blotting，免疫组织化学，Quantitative Real-time PCR 的实验 方法检测大鼠肠相关DRG 神经元中NaV 1.8，NaV 1.9 以及CBS 蛋白和mRNA 表达情 况。 结果 1. NMD 显著增加成年大鼠对直结肠扩张的反应性，表现在AWR 分数的显著 增加以及痛阈的降低。腹腔注射H S 合酶CBS 的拮抗剂AOAA 后，可以显著降低 2 实验组大鼠的AWR 分数，并呈现剂量和时间依赖性。 2. 全细胞膜片钳记录显示，与对照组相比，NMD 显著增加肠相关DRG 神经 元(T13-L2) 的兴奋性；进一步检测显示NMD 显著增加TTX-R 钠通道的电流密度， 而TTX-S 钠电流密度没有明显变化。 3. 数据分析后显示，和对照组相比，NMD 组的激活曲线显著左移，而失活 曲线没有显著变化。另外，NMD 处理后，TTX-R 钠通道的激活时间显著缩短，失 I 中文摘要 内源性硫化氢合成酶参与新生期母爱剥夺诱导成年大鼠内脏过敏的外周机制研究 活时间没有显著变化。 4. NMD 处理组7 周大鼠肠相关DRG 神经元（T13-L2 ）中，NaV 1.8 受体蛋白 表达显著增加，肠相关DRG 神经元中NaV 1.8 的mRNA 总量没有显著变化。 5. 连续腹腔注射AOAA 可以显著翻转NMD 组大鼠肠相关DRG 神经元的兴 奋性，还可以显著降低TTX-R 的钠通道的电流密度，并使TTX-R 钠通道的激活曲 线右移。另外AOAA 还可以显著降低NMD 引起的肠DRG 神经元中NaV 1.8 的高 表达。 6. 外界灌流H S 的供体NaHS,可以显著增加正常大鼠肠相关DRG 神经元的 2 兴奋性，还可以显著增加TTX-R 钠通道的电流密度，使TTX-R 钠通道的激活曲线 左移。另外，给与PKA 的拮抗剂H-89 可以显著降低NaHS 引起的电流密度的增加。 结论 以上实验结果表明H S 合酶CBS 可能是通过PKA 介导的TTX-R 钠通道的激 2 活和NaV 1.8 蛋白的高表达，从而增加TTX-R 钠通道的电流密度，导致肠相关DRG 神经元兴奋性的增加进而参与到外周痛觉信号的调制，最终导致内脏痛过敏。因 此本研究在一定程度上揭示了功能性胃肠疾病如 IBS 病人慢性内脏痛产生的分子 机制，从而可能为慢性内脏痛的治疗提供了更有效的方案。 关键词：硫化氢; 背根神经节；新生期母爱剥夺；肠易激综合征；内脏痛过敏； 电压门控性钠通道 作