溶藻弧菌ompW基因的克隆表达及DNA疫苗的研制.pdfVIP

溶藻弧菌ompW基因的克隆表达及DNA疫苗的研制 摘 要 溶藻弧菌(Vibrio 是一种嗜温性、嗜盐性的革兰氏阴性菌，广泛分布于世界各地海水及河口处、海 洋动物中，是引起海水养殖鱼、虾、贝类爆发性弧菌疾病的主要病原之一。DNA 疫苗作为第三代疫苗在水产中的研究已具有悠久的历史，并取得卓越的成效，对 溶藻弧菌DNA疫苗的研究将为水产养殖业的健康发展提供一条可行之道。 本实验以实验室从湛江养殖区域内分离保存得到的溶藻弧菌有毒株为研究 对象，以该菌基因组为模板，采用改进后的热不对称交错PCR(Thermal Interlaced Asymmetric 得到的片段与载体进行连接，转化到DH5Q杆菌中，经蓝白斑、抗性筛选、菌 液PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆送生物公司进行测序。测序结果表明：获得 database中溶藻弧菌菌株外膜蛋白W ompW基因全长。获得的全长与GenBank 序列进行同源性分析，所得到序列同其他序列的同源性高达98％。 将经双酶切后的全长序列与原核表达载体pET-21a进行连接，构建重组质 粒，经抗性筛选、菌液PCR鉴定的阳性克隆送生物公司进行测序，测序结果正 确后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，经实验分析得到重 组蛋白表达的优化条件：在37℃，0．7mmol／LIPTG的浓度下诱导4h，重组蛋白 能得到大量表达。以镍亲和层析柱纯化后的重组蛋白与本实验室自制的兔抗溶藻 弧菌血清进行western．blot，实验结果表明所得到的重组蛋白与抗血清特异性结 合能力强。 以EcoRI／Xho 在T4连接酶的作用下构建重组真核表达载体pcDNA．0mpW．重组质粒转入DH5 口，测序正确后，扩大培养提取重组质粒。以0．1mol／LPBS稀释质粒后按每尾鱼 251aL的剂量(含有质粒5-tg)对眼斑拟石首鱼进行免疫，以注射相同剂量的空 pcDNA3．1(+)质粒、PBS缓冲液为阴性和空白对照组，免疫方式采取背部肌肉注 射法。免疫三周后以溶藻弧菌对眼斑拟石首鱼进行攻毒，计算免疫保护率。实验 结果表明：由溶藻弧菌外膜蛋白ompW基因所制备的DNA疫苗对美国红鱼的免 疫保护率可达88．9％。 关键词：溶藻弧菌，DNA疫苗，外膜蛋白，TAIL．PCR，免疫保护率 ofVibrio ompWgene Cloningexpression ine andDNAvaccdevelopment Abstract is of and Hbrio to akind vibrionaceae，vibrio，which alginolyticusbelong halophilism addictto for bacteria．It distributionin gentletemperatureGram-negativegenerally aqua marinaand ofallthe itcanbefoundin kindsofmarine estuary world，and many animals，and itisail formariculture vaccineasthemostadvanced pathogens fishes，shrimp，shellfish．DNA method marineani