乙型肝炎病毒基因在人肝癌细胞基因组中整合位点的探讨.pdfVIP

乙型肝炎病毒基因在人肝癌细胞基因组中整合位点的探讨 【目的】 本项目拟在前人研究的基础上，首先利用多种技术平行检测确定受衄V基 因整合而影响表达的宿主基因。然后，采用mRNA基因表达芯片，确定皿V整合 对宿主基因表达影响。在此基础上，通过生物信息学分析，筛选部分与细胞分化 及细胞凋亡相关的整合基因，确定咖V整合对目的基因功能的影响以及在肿瘤 发生中的意义。项目的完成，将从遗传信息到细胞功能水平上部分阐释耶V感 染导致肝细胞癌发生的机制。这对于预防HBV相关性肝细胞癌的发生以及开发 相关的治疗手段具有重要的指导意义。 【方法】 1．I晦床样本的收集 临床样本收集自广东医学院附属医院，深圳市第三人民医院，广东省人民医 院，深圳市第二人民医院等住院肝细胞癌患者的手术切下组织，同时收集病人的 病例资料。 2．肝癌组织DNA样本的提取 蛋白酶K法，具体操作按分子克隆第三版的方法进行。 3．确定珈3VDNA在宿主染色体上整合位点的PCR方法的建立 PCR方法是目前确定整合位点的主流方法，根据文献报道，mer∞．PCR、 砧u．PCR、CLM．PCR较为常用。但是三种方法在确定整合位点准确率方面效果 如何，据作者检索近年文献，尚未见报道。为了明确在我国人种遗传背景下此三 种PCR方法的效果，先对三种方法进行比较。 4．整合位点在人类染色体上的精确定位 将以上三种PCR产物克隆至■、bc研克隆载体上，对克隆后的载体进行双向 D1呵A测序，将测序结果输入BLAST中，确定整合位点在染色体上的具体位置。 5．整合位点附近相应基因的查找与可能引起的基因表达变化的推测 ? 确定整合位点后，在逝；毖塑Q望蝗：堡墼：鲤必丛墅；厶鱼塑型：g曼殴班曼』匹i 逝；趟：鲤趔：嘤等生物信息学网站上查找整合位点附近的相应基 因，并且查找整合后基因可能受到影响，其中包括基因突变，基因缺失，阅读框 架受破坏，调控区改变等，列出候选基因进行进一步验证。 6．受整合而影响的基因的生物学验证 将上面列出的候选基因采用生物学方法逐一验证，如以m】盼『A基因芯片法， 定量PCR及westem．b10t方法观察其表达水平的变化，将该基因的m】心队进行 逆转录并且测序观察其是否有突变，以EMSA法观察其启动子区转录因子的结 合情况的改变等。 【结果】 1．采用m阳嗽PCR方法检测PCR产物后得到7个特异性电泳条带，克隆 后得到测序结果22个，经序列比对发现3个整合位点；采用砧u-PCR方法，产 物电泳得到13个特异性条带，得到测序结果32个，序列比对未发现整合位点； 采用CL，M．PCR方法，得到12个特异性电泳条带，得到测序结果4个，未发现 整合位点。 ． 2．利用Blast工具进行序列对比，参与整合的细胞基因命名为CCNEl，定 位于19q12，该基因在细胞周期的G1期向S期转换过程中发挥作用，在许多肿 瘤细胞中可观察到该基因的过度表达，并由此引发染色体的不稳定。它所编码的 蛋白属于高度保守的细胞周期蛋白家族，在细胞周期进程中发挥重要作用，其它 两个整合位点分别位于2q32．2和22q12。 【结论】 1．在查找腿V整合位点的研究中，hⅣ髓∞PCR方法具有较稳定的扩增 能力及较高的位点检测率。 2．在瑚≥sAg阳性的HCC细胞基因组中存在皿x参与的整合位点；宿主 肝细胞基因CCNEl在细胞癌变的过程中可能发挥重要作用。 【关键词】PcR方法；乙型肝炎病毒：乙肝病毒基因x基因区段：乙肝表面 抗原；肝细胞癌；基因整合 2 AbstI鼍ct 【objectivel onmebaSis ist0find0m恤 of咖work，恤0bjcct毗of仳s糟∞ardh di伍苦船t e丘．ectson methods，then in：yolved蓼锄esthroug