益生菌对致病E.coli黏附鸡肠纹状缘膜的抑制作用.pdf

摘要 摘 要 本研究以雏鸡肠粘膜为模型，以两株益生菌（嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）和鸡致病性大 肠杆菌为研究对象，利用亲和组织化学ABC法、固相黏附和固相黏附抑制法从两方面探讨了 益生菌拮抗病原菌的机理。 建立实验动物模型，选取1 日龄的健康肉仔鸡随机分成六组，分别进行常规饲养、饮水给 予一定量的鸡致病性大肠杆菌、饲喂一定量的干酪乳杆菌活菌体、饲喂干酪乳杆菌活菌体、 饲喂嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌混合菌体和饲喂鸡致病性大肠杆菌后再饲喂嗜酸乳杆菌和干酪 乳杆菌复合菌。利用已建立的实验动物模型将不同实验组别的肠粘膜标本进行凝集素亲合组 织化学ABC法染色，以此验证益生菌是否能够通过改变纹状缘膜上受体的糖基化状态来竞争 排斥病原菌与纹状缘膜的结合。另外，提取雏鸡小肠粘膜纹状缘膜和细菌粘附素进行固相黏 附和黏附抑制实验，并用斯卡恰特作图法和希尔标绘法进行作图分析，从分子层面对益生菌 拮抗病原菌的机理进行探讨。研究结果表明： 鸡致病性大肠杆菌在雏鸡纹状缘膜上的受体主要为 D-甘露糖结合物和少量的 N- 乙酰神 经氨酸结合物；嗜酸乳杆菌黏附的受体可能为 L-岩藻糖结合物和 N- 乙酰氨基葡萄糖结合物； 干酪乳杆菌的受体为 N- 乙酰神经氨酸结合物，另外与半乳糖结合物也有关。 两株益生菌和大肠杆菌均可改变肠纹状缘膜上某些特异性糖基结构的表达。鸡致病性大 肠杆菌可增加除回肠外各肠段的 D-甘露糖凝集素受体和N- 乙酰神经氨酸凝集素受体的表达， 后者的增量相对较小；嗜酸乳杆菌可增加各肠段纹状缘膜 L-岩藻糖和 N- 乙酰神经氨酸凝集素 受体的表达；干酪乳杆菌增加了 N- 乙酰神经氨酸和半乳糖凝集素受体的表达，但同时也减少 了 N- 乙酰氨基半乳糖凝集素受体的表达量；饲喂益生菌的雏鸡纹状缘膜上的 D-甘露糖凝集 素受体的表达量都略有降低，但差异不显著。 大肠杆菌菌毛黏附素和两株益生菌的表面黏附素对纹状缘膜的黏附都具有浓度和时间的 依赖性，温度对其无明显影响。Hill系数分析表明，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌表层蛋白在肠粘 膜上都存在多个黏附位点，且亲和力大小不一，这可能是益生菌能抑制多种病原体与宿主结 合的原因。大肠杆菌菌毛在纹状缘膜上也存在两种黏附位点，一种是高亲和力的，一种是低 亲和力的，且结合位点之间存在负协同效应。而两种益生菌的胞壁肽聚糖在纹状缘膜上均存 在一种黏附位点，并具有较强的正协同效应。两种益生菌的表层蛋白和肽聚糖对菌毛黏附都 具有明显的抑制作用，肽聚糖的抑制作用相对较小。加入少量益生菌粘附素后，菌毛的最大 粘附量略有减少，但非特异性粘附量显著降低，高亲和力黏附常数值升高。加入大量的益生 菌粘附素后，菌毛的最大粘附量显著降低，非特异性黏附接近于零，菌毛在纹状缘膜上只存 在一种的黏附位点，且亲和力也明显降低。 关键词：益生菌；凝集素；凝集素受体；肠纹状缘膜；黏附 I Abstract Study on the Inhibition of Chicken Pathogenic E. coli Binding to Chicken Intestinal Brush Border Membrane by Probioties Abstract The study treated chicken Intestinal mucous membrane as the model and selected two probio- tics (L. acidophilus and L.casei) and an avian pathogenic E. coli as research objects, to investiga- te the competitive exclusion mechanism of probiotics by lectin-binding histochemistry ABC and solid phase binding and binding inhibit