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2011-07 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：芽孢杆菌和大肠杆菌质粒标准品的制备 试验人员：刘云浩 试验负责：蓝江林 报告日期：2011年07月 计数月份：2011年07月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计不足，实施错误 6%-10% 设计不全，实验无果 11%-15% 设计可以，实施不全 16%-20% 设计完整，分布实施 21%-25% 实验不全，记载无果 26%-30% 实验不足，记载不全 31%-35% 独立实验，记载不全 36%-40% 分布实验，记载完整 41%-45% 目的明确，实验完成 46%-50% 实验完整，记载清晰 51%-55% 实验系统，结果可信 56%-60% 实验创新，分析清晰 61%-65% 实验创新，结论清晰 66%-70% 实验完整，统计清晰 71%-75% 实验系统，数据可靠 76%-80% 报告完整，文章雏形 81%-85% 结构合理，分析有据 86%-90% 逻辑清晰，统计合理 91%-95% 图表完整，写作流畅 96%-100% 文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591 HYPERLINK / fjat HYPERLINK / . 1．试验目的 鉴于之前提取的芽孢杆菌和大肠杆菌的质粒都有RNA的污染，本试验采用天根生物的质粒提取试剂盒来提取重组质粒，以求获得纯度很高的质粒，为下一步质粒标准品的获取奠定基础。 2．试验方法 2.1 材料和试剂 2.1.1材料 TIANprep MiNi Plasmid Kit（天根生物）。 2.1.2试剂和仪器 无水乙醇，去离子水，电泳仪，核酸蛋白定量仪。 2.2 方法 2.2.1 质粒提取步骤 1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。 2. 取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 4. 向离心管中加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 5. 向离心管中加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g )离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 7. 可选步骤：向吸附柱CP3中加入500 μl去蛋白液PD，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是end A +宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM系列， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA -宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。 8. 向吸附柱CP3中加入600 ul漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 9. 重复操作步骤8。 10. 将吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去