碱蓬液泡型Na-%27%2b-%2fH-%27%2b-逆向运输蛋白基因克隆及其向苜蓿中转化.pdf

碱蓬液泡型Na+／H+逆向运输蛋白基因的克隆 及其向苜蓿中的转化 摘要 盐碱土是地球上广泛分布的一种土壤类型，然而由于灌溉方式不当，盐碱地 面积不断增加，造成大面积土地被迫撂荒和植被的第一性生产力下降，限制了农 业的发展，加剧了生态环境的恶化。在治理盐碱地的各项技术措施中，生物措旌 被认为是最有效的改良途径。即通过DNA重组技术，分离并转移植物耐盐基因， 使其能在转基因植物中顺利表达，以提高转基因植物的耐盐性，培养优良抗盐品 种，来开发利用盐碱地。液泡型Na+／FF逆向运输蛋白基因是渗透胁迫调节基因之 一，编码负责N分／H+交换的一种跨膜运输蛋白基因。Na+／}r逆向运输蛋白，不仅 能保持植物细胞内低Na冰平，而且在细胞器的发生及离子平衡过程中还具有渗 透调节功能，是保持细胞pH和离子平衡的关键因子。本论文以生长在吉林省白 城地区的碱蓬(SuaedacorMculata)为植物材料，首次分离并克隆了液泡型 进行了序列分析；同时利用该基因构建植物表达载体，通过根癌农杆菌介导的方 法将该基因转入苜蓿中。其主要研究结果如下： 泡型N0∥逆向运输蛋白基因(肠盯土并进行了测序，基因全长为1665bp， 推测的编码蛋白序列包含554个氨基酸残基，将此基因提交到GenBank，登录号 是DQ512716。 2．利用分子生物学软件，对克隆得到的碱蓬№+脚逆向运输蛋白基因的核苷酸序 列以及由此推导出的氨基酸序列进行了各种统计、结构分析和序列比较，得出以 下结论： 分子量为61．2KD。 (2)碱蓬Na+／H+逆向运输蛋白与其它植物的液泡型NaW逆向运输蛋白在核苷酸 和氨基酸水平上有很高同源性；而与质膜型Na．／}r逆向运输蛋白的同源性较低。 初步证明：我们分离的碱蓬№+／H+逆向运输蛋白是液泡型Na+／H+逆向运输蛋白。 (3)碱蓬液泡型Na／H+逆向运输蛋白的氨基酸序列分析表明，ScNHXI氨基端有 12个序列保守的跨膜结构域(TM)，羧基端有亲水尾部。在TM3中有一段十几 没有完全跨过液泡膜具报道这两个跨膜结构域与Na+结合，是液泡型Na．／H+逆向 运输蛋白活性的重要结构域。 (4)碱蓬液泡膜Na．／}r逆向运输蛋白序列中含有Asn的糖基化位点，证明该蛋白 是已糖基化的蛋白。 (5)碱蓬液泡型州逆向运输蛋白序列含有Asp位点，在141位。 3．将碱蓬液泡型Na+／H+逆向运输蛋白基因克隆到表达载体中，通过根癌农杆菌 介导法，完成了兜^删，基因向苜蓿中的转化。 关键词：碱蓬； 盐胁迫：液泡型Na+／}r逆向运输蛋白基因；基因转化 II Abstact Soil isa and of the ofsoil importantland,but salinitymajor type problemsalinity hasbeen the suchas aggravatedby wrongagriculturepractices salinity irrigation．Soil tofood isa constraint toits best limitationof major productionowing cropyield．1nbe forsave in way this is allthemethodsofharuessthesoil problemtransgenicplant the