microRNA（微RNA）的发现、验证及靶基因研究.docVIP

microRNA简介 专家发言消歧义 microRNA MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。miRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF）。成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体（pre-miRNA）并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3′端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA 5＇端第一个碱基对U（尿苷）有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。 ? 形式 ? 作用方式 ? 特异性 ? 差异 ? 选择方法 ? 参考资料 microRNA-形式 1?. pre-miRNA?约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。 制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。 2. pri－miRNA天然pri－miRNA? 从染色体基因文库中调取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体），以强大的CMV启动子操纵该300bp－1000bp microRNA。人工pri－miRNA 选择一个完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体）。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。 ? microRNA-作用方式 microRNA的形式 miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性（不改变mRNA丰度），这种miRNA是目前发现最多的种类；第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA；第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式：当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3′端非翻译区不完全配对结合后，抑制调节基因的翻译。 microRNA-特异性 研究表明MiRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性——在特定的时间、组织才会表达。 细胞特异性或组织特异性是miRNA表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性暗示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。 siRNA是RNAi途径的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。为了能够清楚地让读者弄清两者之间的差异之处，笔者特别将它们之间的差别划分入三个大的阶段：起源阶段、成熟阶段和功能阶段（即调节基因表达的作用阶段）。 在描述两者的差异之前，有必要先说一说它们的共同点： 1．? MiRNA和siRNA都是由22个左右的核苷组成； 2．? 它们都是Dicer酶的产物； 3．? 它们在起干扰、调节作用时都会和RISC复合体结合； 4．? 它们都可以在转录后和翻译水平