甘蔗△^1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）的克隆及其表达分析.pdfVIP

第 30卷 第 9期 热 带 作 物 学 报 V01．30 No．9 2009年 9月 CHINESE JOURNAL OFTROPICAL CROPS Sep．2009 甘蔗△1_吡咯啉一5一羧酸合成酶基因(P5CS) 的克隆及其表达分析 张积森 一，陈由强 一，李 伟 ，阙友雄 ，叶冰莹 ，陈如凯 ，张木清 1福建师范大学生命科学学院．福州 350108 2农业部甘蔗遗传改 良重点开放实验室．福州 350002 摘要 △L吡咯琳一5一羧酸合成酶是植物脯氨酸合成过程的关键酶。应用 同源性克隆结合 RACE技术获得甘蔗 P5CS基因cDNA全长序列 2714bp，其中5端非编码 区为226bp，3端非编码区340bp，poly(A)上游有 1个聚腺 苷酸五碱基 AATAAA；开放读码框为2148bp编码715个氨基酸 ，含双功能域 ；其编码 的蛋 白分子量为 77．7ku， 等电点为 6．47。序列比对分析结果表明， cs基因的4个主要功能区(doraain)中亮氨酸功能区(Leucinedomain) 相对不保守 ．其它功能区均较为保守。对 17个物种 的P5CS基 因进行聚类分析 。结果与公认的生物学分类及进 化关系吻合。对甘蔗 P5CS在根 、茎 、叶的表达进行实时 PCR分析 ，结果表 明，该基因在茎 、叶表达量相近 ， 但在根 的表达量极低 关键词 甘蔗 ；脯氨酸 ；△L吡咯啉一5一羧酸合成酶 ；荧光实时PCR 中图分类号 $566．1：9943．2 脯氨酸累积是植物对水分胁迫等逆境做出普遍适应性反应的一种机制 。研究表 明，脯氨酸累积与植 物对干旱和盐胁迫的适应性呈正相关性关系I【zI。虽然对脯氨酸累积的途径看法不一3【一，一般认为脯氨酸 的生物合成途径有 2种 ．即谷氨酸途径和鸟氨酸途径 61其 中谷氨酸途径是指谷氨酸通过两步连续的还 原反应合成脯氨酸的过程 ，中间产物为△I-吡咯啉一5一羧酸 (P5C)，催化反应的酶为△一·吡咯啉一5一羧酸合 成酶(△Lpyrroline一5-carboxylatesynthetase，P5CS：EC2．7．2．11／1．2．2．41)和P5C还原酶 (pyrroline一5--carboxylate reductase，P5CR，EC 1．5．1．2)昀。通过对PSCS和 P5CR编码基 因的过量表达植物体的研究发现 ，P5CS在 植物中的过量表达促进 了脯氨酸的大量合成和植物耐旱抗逆能力的提高 zu]．而 P5CR的转化植株却不 能明显提高脯氨酸含量B2，131 由此认为谷氨酸途径的2个酶中， 具有更重要的意义，这使克隆该基因 成为植物抗逆基因工程研究的热点2【．6,14-171 甘蔗是我国最重要的糖料作物．旱植蔗面积已占全国植蔗总面积的 85％以上 ．因而研究甘蔗的脯氨 酸代谢的关键酶基因具有重要的意义 笔者应用同源克隆结合 RACE技术对甘蔗的P5CS基因进行分离和 序列分析 ．并对该基因在甘蔗的部分组织部位的表达进行分析 ．以期为甘蔗乃至植物抗旱基因工程提供 候选基因和理论依据 1 材料和方法 ) ， 1．1 植物材料 供试甘蔗品种为福农 95—1702，由福建农林大学甘蔗研究所提供。取生长健壮 、长势一致 的蔗茎 ，清 水浸泡、灭菌 24h后，种于经高压灭菌过的细沙 中，置于光照培养箱中，昼夜光照时间均为 12h，温度 基金资助 ：国家 自然科学基金(No；国家 “863”计划 “高蓄能能源甘蔗新品种 的创制与应用”(No．2007AA100701)；国家农业 公益性行业科研专项 (No．nyhyzx07—019)，福建省 自f~ (No．2009J05058)。 作者简介 ：张积森，男，1977年生，博士。研究方向：植物分子生物学。E-mail：zjise