人亲环素D重组表达及融合蛋白活性测定.pdfVIP

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2017-09-02 发布于安徽
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人亲环素D重组表达及融合蛋白活性测定.pdf

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摘要摘要筛选，从而找到一种药物高通量筛选的方法，本实验拟构建原核表达重组质粒反异构酶(peptidyl．prolylcis．transisomerases，PPIase)活性。 SimpleVector直接连接，连接产物转化大肠杆菌JM一109，的cDNA与pMDl8-T 经蓝白斑筛选，挑选白色克隆扩增、鉴定为重组质粒pMDl8一T／CypD。 I、SalI双酶切，低熔点琼脂糖凝胶 pMD18-T／CypD和pGEX-4T-1分别用EcoR 电泳回收所需片段，将两者连接后转化大肠杆菌，提取重组质粒 pGEX一4T一1／CypD，进行酶切及核苷酸序列测序鉴定。将阳性克隆扩增并优化表达条件，采用亲和层析方法提取纯化融合蛋白GST—CypD。利用糜蛋白酶偶联法来测定融合蛋白中CypD的氨基脯氨酸顺反异构酶活性。结果：扩增出CypD的全长cDNA编码区，并重组到原核表达质粒载体pGEX．4T．1 中，重组质粒pGEX．4T．1／CypD转化感受态大肠杆菌后，经异丙基p．D．硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出相对分子质量为66KD的融合蛋白，活性测定表明融合蛋白GST-CypD具有PPIase活性。结论：成功克隆了人CypD基因的原核表达重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达，提取纯化后获得有生物活性的融合蛋白GST-CypD，为进一步研究CypD蛋白通过调控mPTP开放，进而在细胞死亡的过程中所起的作用及其机制奠定了基础。关键词：亲环素D；基因克隆：融合蛋白；PPIase ABSTRACT ABSTRACT ordertoresearchtheroleof to Objective：In cyclophilinD(CypD) targetproteins to and out finda proteincarrydrugscreening drughi曲-througthputscreening is to constructthe method，thisstudy prokaryoticexpressionplasmid and offusion in GST-CypDvitro， pGEX一4T-1／CypD，extractionpurificationprotein anddeterminetheir · activity． Methods：RT-PCRmethodto thefull cDNAfromthe amplify lengthCypD gene 7721celland the with Vector， purifiedproductsofcDNA，ligatedpMDl8一TSimple thentransformedintoJM一109．thewhitecloneswereselectedtobe and amplified identified，whichwascalle