微生物发酵技术实训教案10713.docVIP

野生型菌株的筛选 经典的发酵产物来自微生物，土壤是微生物的大本营。生产菌株的选育源头都来自于自然界。如何从自然界中筛选目的微生物，可以根据目的微生物和产物的特性作为筛选条件，进行筛选提高筛选效率，从而有效的解决菌株从无到有的问题。 实训一 产淀粉酶菌株的筛选 一． 实 验 目 的 筛选一株能够合成分解淀粉的微生物。 二． 原 理 自然界微生物种类繁多，有些微生物能够以淀粉作为碳源进行生长繁殖是因为它们能够合成分泌淀粉酶，因此我们能够从自然界中定向分离出合成淀粉酶的微生物。当能合成淀粉酶的微生物在固体培养基中生长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围，将菌落周围的淀粉水解成为小分量的糊精、聚糖和单糖。这些水解物不能包裹单质碘从而在菌体周围形成透明圈。 三. 材料与仪器 1. 材料 蛋白胨，牛肉膏，NaCl，琼脂条，可溶性淀粉，碘液。 2. 仪器 牛皮纸、培养皿、试管、涂布棒、恒温培养箱、玻璃珠 四．方法与步骤 1. 筛选培养基的配置 可溶性淀粉 2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，琼脂 20g ，水 1000ml 2. 碘液的配置 称取KI 2.0g，用50mL去纯水溶解KI，迅速称量I2 0.5g并加入KI溶液中，用纯水定容到100ml，搅拌溶解后保存在棕色瓶中，橡皮塞封口。 3. 土样的采集 ⑴ 每大组取三种不同环境的土样并记录当时取样环境情况（每一小组以其中一个地方进行分离）。 ⑵ 以小组为单位进行稀释分离。 取土样1克，加入9mL 无菌水，逐步稀释至105、106、107。（每个梯度涂2个瓶皿）。 ⑶ 30℃恒温培养48小时 ⑷ 产淀粉酶菌株的鉴定。 挑选单菌落影印到无菌瓶皿上，同时用签字笔对各单菌落在底皿标号。标记接种过的培养皿30℃培养24h，取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。与此对应找出合成淀粉酶的菌株。 比透明圈＝透明圈直径（mm）/ 菌落直径（mm） [5]每小组调去活性优良的菌株接入斜面试管保存，待下一次用。 五．记录与结果 1.环境情况 地点一： 地点二： 地点三： 2. 绘制出透明圈 数据共享 地点一 地点二 地点三 产酶菌落数 比透明圈 六．结果分析 从不同地点获得的结果进行分析为什么会出现这样的差异你可以初步得出什么样的结论。 七 作业 1. 为什么要用淀粉作为碳源？ 2. 在观察结果的过程中为什么要及时观察,否则会有什么的后果. 3. 为什么同样一个同样要稀释几个不同梯度进行涂平板. 菌种选育 微生物菌种的选育目的防止菌种退化解决生产实际问题，提高生产能力，提高产品质量，开发新产品。目前菌种选育的方法主要有自然选育、诱变育种、杂交育种、分子育种等手段。但是诱变育种还是育种的主流，诱变育种根据诱变剂的种类可分为化学诱变和物理诱变。本实验以紫外线作为物理剂进行诱变。诱变过程一般包括诱变出发菌株的选择、诱变剂量的选择和诱变及其筛选。 实训二 产淀粉酶菌株的诱变育种 一. 目的 在最佳诱变剂量下选育发生淀粉酶产量发生正突变的菌株。 二. 原理 发生正突变的概率约为10-8左右，需要在大量的照射菌落中寻找发生正突变的菌株。如果从大量的待选辐照菌中进行定量或半定量筛选分析，工作量巨大，不切合实际。一般根据经验依据微生物的形态和高产菌的关系或根据比透明圈与对照的比透明大小进行筛选。形成透明圈的大小不仅与遗传有关还与培养条件有关。为了消除培养环境的误差，在此规定当比透明大于对照比透明25%为正突变，小于25%为负突变，在此±25%之间认为是没有发生突变。 三. 材料与仪器 1. 材料（出发菌株选取一个；例如枯草芽孢杆菌） 蛋白胨，牛肉膏，NaCl，琼脂条，可溶性淀粉，碘液。 2. 仪器 紫外灯、磁力搅拌器、报纸、红灯泡、灯口、电线、插座、瓶皿、无菌三角瓶（内含玻璃珠）、含有磁针的无菌瓶皿 四．方法与步骤 1. 培养基 可溶性淀粉 2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，琼脂 20g ，水 1000ml 2. 无菌生理盐水 3. 出发菌株的制备（无菌条件下操作） 将出发菌株从试管中用25mL生理盐水多次洗出洗出，倒入含有玻璃珠的无菌三角瓶中，进行反复振荡20min。 4. 紫外线诱变及初筛 选择合适辐照剂量对出发菌株进行诱变，接入摇瓶培养2个小时后稀释涂布平板，用报纸包裹在黑暗条件下培养48h，然后喷洒稀碘液记录比透明圈。 比透明圈＝透明圈直径（mm）/ 菌落直径（mm） 五.记录汇总与分析 1.列出各组结果 2.各做进行对比分析在不同剂量条件的正突变发生率和发生正突变幅度和计量的关系以及发生最大突变的幅度在什么剂量条件下。 六 讨论 七作业 1. 统计不同剂量条件的正