CP与植物和昆虫互作研究.pptVIP

RSV CP与植物和昆虫互作的研究 * * 赵淑玲 2008. 12. 6 研究背景 研究内容 研究方法 特色及创新处 研究计划及预期成果 RSV引起的病症 病症：水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)是水稻条纹叶枯病的致病原，该病毒靠灰飞虱传播。 症状：感病水稻发病初期叶片沿叶脉呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后常连成褪绿大片。早期发病植株枯死，发病迟的只在剑叶或叶鞘上有褪色斑，但抽穗不良或穗畸形不实，病株分蘖一般减少。 水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本发现,在我国自1963年在苏南地区始发后,已经扩散到18个省市,特别是自2001年来在江苏和河南连续暴发,造成了水稻生产上的巨大损失。因此如何防止病害发生和控制病害流行成为研究者迫切希望解决的问题。 RSV的危害 RSV基因组结构和功能 RNA1 RdRp RNA2 RNA3 NS2 NSvc2 NS3 CP RNA4 SP MP RdRp: RNA聚合酶 NSvc2: 推测为糖蛋白 NS3：RNA沉默抑制子 CP： 外壳蛋白 SP： 症状相关蛋白 MP: 移动蛋白 3506 nts 2472 nts 2137 nts 8970 nts RSV 研究情况 初步研究的方面 基因组序列、某些基因功能 转基因的抗病毒植物 还需研究的方面 基因功能 病毒的致病机理 病毒的传播机制 深入研究难点 RSV的侵染性克隆难以建立 灰飞虱细胞系还未建立 立项依据及研究意义 RSV与宿主互作研究的重要性 研究的创新性 结合实验条件 研究内容 CP与水稻的互作 构建水稻cDNA文库 筛选cDNA文库中与CP互作的蛋白 蛋白功能分析 cDNA 文库：生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段集合。 测序、序列比对，分析基因功能。 方法：酵母双杂交系统 NSvc2蛋白是否为病毒传播必需 CP、NSvc2蛋白是否存在相互作用 NSvc2蛋白是否具有膜融合功能 酵母双杂交系统验证蛋白间的互作 利用杆状病毒表达系统使目的蛋白展示在细胞膜上，然后研究膜融合功能 CP、NSvc2蛋白与昆虫细胞的互作 水稻cDNA 文库构建 研究方法 总RNA mRNA的分离 AAAA TT TT mRNA cDNA cDNA第一链合成 AAAA TT TT cDNA第二链合成 AAAA 5’ AAAA TT TT 加接头，连接载体 构建cDNA文库 Oligo(dT)纤维柱分离 逆转录 RNaseH DNA polymerase DNA ligase 重组载体感染宿主菌 酵母双杂交系统 酵母激活因子 GAL4由N端的DNA结合域(BD)和C端的转录激活域(AD)组成。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列结合，而转录激活域则能激活下游的基因进行转录。只有BD和AD共同存在形成复合体时才能激活下游基因转录。 在酵母双杂交系统中，编码这两个结构域的DNA片段分别被构建在两个独立的表达载体上，一个表达载体含有BD基因片段与已知蛋白形成的融合基因，另一载体含AD基因片段与未知cDNA形成的融合基因。若两种蛋白间互作便会形成复合体，启动报告基因的表达 BD X COOH Gal4 NH2 + cDNA library COOH cDNA AD Gal4 NH2 共转化 AD Gal4 ? BD X Promoter LacZ Reporter Promoter LacZ Reporter BD X ? AD 酵母双杂交系统原理 酵母双杂交基本过程 蛋白细胞膜表面表达载体构建 NSvc2蛋白前端连接gp64的信号肽序列，后端连接VSV G蛋白的跨膜结构域， 这样NSvc2蛋白表达后便成功展现在了昆虫细胞膜上 gp64 sp cp/NSvc2 VSV G tm 目的蛋白 信号肽 跨膜域 杆状病毒表达系统表达蛋白 细胞膜融合功能的研究 目的蛋白在细胞膜表面的表达检测 抗体标记TRITC， TRITC是一种荧光素，用激光共聚焦显微镜观察则细胞的表面出现橙红色荧光。 目的蛋白膜融合功能检测 细胞低pH条件下诱导，然后观察细胞融合 的。 pH shift time 0 +4h +7h