乳癌14-3-3 sigma基因异常甲基化导致其基因沉默.ppt

细胞系 乳癌细胞系： Hs578T,MDA-MB-231, MDA-MB-435, ：21PT ， 21MT and MCF-7 人乳腺上皮细胞系 (HMEC) ： MCF-10A，161, 184, 172, and 48等 细胞表达缺失 表达缺失的原因 LOH：PCR（1/20） 编码区突变：PCR测序、SSCP（均正常） 转录因子是否缺乏：外源基因导入 DNA甲基化：MSP及测序 14-3-3 sigma基因甲基化 5-aza-dC处理后 14-3-3 sigma重新表达情况 14-3-3 sigma生理功能 细胞周期及检查点 gama-射线对乳癌细胞系的损伤影响 14-3-3 sigma在乳腺癌组织的甲基化（34/40，85%） * * * 乳癌14-3-3 sigma基因异常甲基化导致其基因沉默钟政荣蚌埠医学院第一附属医院检验科 背 景 乳癌是危害妇女生命健康的主要恶性肿瘤:2000年USA，18万/y被诊断，4.4万死亡；我国发生率和死亡率都逐年增高。 DNA甲基化是哺乳类动物遗传外修饰的重要调控方式 ：女性X染色体的失活、肿瘤等。目前发现，有100多种基因肿瘤时发生甲基化。 DNA甲基化 DNA甲基化主要发生在基因启动子或第一外显子中-CG-（-CpG-）二核苷酸中的C发生甲基化变成-mCG- DNA甲基化导致基因沉默的机制 1. 直接抑制 2. 改变染色质构象 DNA甲基化调控机制 DNA甲基化检测方法 检测方法：甲基化特异性PCR（MSP），敏感、特异 MSP-亚硫酸氢盐修饰结果 非甲基化 DNA: 修饰前：AGG CGTTCTAG CGAAGC 修饰后：AGG UGTTUTAG UGAAGU 甲基化 DNA : 修饰前：AGGmCGTTCTAGmCGAAGC 修饰后：AGG CGTTUTAG CGAAGU 14-3-3 sigma是一种特异性上皮细胞因子，被认为是肿瘤抑制基因，本研究旨在探讨乳癌14-3-3 sigma基因甲基化状态及其在肿瘤组织的表达情况，为进一步研发肿瘤诊断的分子标志奠定基础 材 料 与 方 法 标本来源 肿瘤组织：浸润性导管癌30例，浸润性小叶癌3例，浸润性导管癌伴浸润性小叶癌、浸润性导管癌伴微乳头状癌、导管内癌、小管癌、硬癌、髓样癌、腺癌各1例，所有标本来源于蚌埠医学院第一附属医院外科手术患者 MSP引物 M：甲基化引物 sence：TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC antisence：CCTCTAACCGCCCACCACG 产物大小：105bp U：非甲基化引物 sence：ATGGTAGTTTTTATGAAAGGTGTT antisence：CCCTCTAACCACCCACCACA 产物大小：107bp 结果与讨论 14-3-3 sigma在乳腺癌组织的表达缺失 Northern Blot Analysis（组织水平表达缺失：35/40，87.5%） 结果表明：乳癌组织14-3-3sigma表达缺失是一经常性事件 Northern Blot Analysis 转录因子活性检测 外源报告基因（融合GFP）导入检测转录因子活性。 A：Northern blot分析14-3-3sigma表达MCF-10A(C);B:转染后GFP活性分析 MSP analysis of DNA from cell line. (A) HMEC finite life span strains (184 and 161) and immortalized HMEC lines (184B5,184A1-15, 184A1-99, MCF-10A, and HBL-100), and breast cancer cell lines, Hs578T, MCF-7, MDA-MB-231, and MDA-MB-435 基因甲基化 基因沉默 因果关系 ？ 14-3-3 sigma表达缺失时存在其基因甲基化 14-3-3sigma基因甲基化导致其基因沉默 ？ sigma 基因沉默 肿瘤发生 目前的研究表明，14-3-3sigma是一p53诱导基因，DNA损伤时，诱导14-3-3 sigma蛋白表达增加，阻止细胞进入M期而停止在G2期。停留在G2期的细胞因而有时间进行DNA修复，而不能修复的细胞则发生凋亡，从而控制细胞发生恶变 σ-negative cells have a defective G2 cell cycle checkpoint and have an increased number of G2 type chromosomal aberrations.