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RNA检测及RT-PCR实验技术 罗虹 2008-11-27 RNA质量检测 RNA质量检测 RNA质量检测 NanoDrop ND1000 （分光光度计） 使用TE溶解， A260 /A280 比值低： 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机项。减少起始样品量，确保裂解完 全、彻底。加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办 法是用 PCI 重新抽提一次，再沉淀，溶解。 A260 /A230 比值低： 抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。解决办法 是再沉淀一次后，溶解。 组织内杂质残留：一般为多糖类杂质。解决办法是改用其它办法，如 LiCl 沉淀。 Agilent 2100（毛细管电泳） RIN（1-10）：比值越高完整型越好，没有读出，可以考虑其他的参考因素。 28S：18S 1.5至2.5之间认为正常。低于1.5可能出现降解。 琼脂糖胶检测 非变性电泳：使用 2ug 上样量，电压小于 6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频 繁混匀两极的缓冲液。(以 DNA 标准为参照，28S 和 18S 分别位于 2.0kb 和 0.9kb 左右。) 变性电泳：EB 与单链的结合能力要差一些，样品电泳中相对不易降解。 Nano drop RNA质量检测 RNA质量检测 降解的样品 mRNA提取 利用真核生物mRNA 3‘末端含有多聚(A)+ 的特点 纤维素柱:当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作 用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降 低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过 两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。 磁珠: 磁珠表面是oligo dT, 通过它和mRNA的poly A结合， 从而达到提取mRNA的目的。 1. 取10-20ug total RNA至一RNase free 的管中，用DEPC水稀释至50ul 。混匀，65ºC变性5分钟， 打开二级结构，然后立即将样品置于冰上。 2. 将Oligo （dT ）18磁珠摇匀，吸取100ul于1.5ml 不粘的EP管中。 3. 将磁珠用binding buffer 洗两次。清洗过程为：将100ul binding buffer 加入含磁珠的EP管，轻弹 混匀，置于MPC上1min，小心吸出上清。 4. 将磁珠重新悬浮于50ul Binding buffer，将第一步中制得的total RNA加入管中，室温下振荡5min 。 （Thermomixer上转速不能超过500rpm，可放置在垂直混勻器中）。 5. 将EP管置于MPC （磁分离器）上2min，小心吸出上清。 6. 再用binding buffer清洗磁珠两次。清洗过程为：将100ul binding buffer 加入含磁珠的EP管，轻 弹混匀，置于MPC上2min，小心吸出上清。 7. 在一新的不粘的EP管中加入80ul的binding buffer。 8. 向含磁珠的EP管中加入20ul 10mM Tris-HCl，80℃加热2min将mRNA从磁珠上洗脱下来，迅速 将EP管转至MPC上，转移mRNA至上一步的EP管中，立即将100ul washing buffer加入到磁珠中。 9. 65ºC变性5分钟，打开二级结构，然后立即将样品置于冰上。 10. 同时用washing buffer清洗磁珠两次。清洗过程同上。 11. 将100ul第九步的mRNA样品加入磁珠中，室温下振荡5min 。向含有磁珠的EP管中加入200ul Washing buffer ，将磁珠小心混匀，置于MPC上2分钟，弃去上清。 12. 吸出并弃去上清液，再用washing buffer清洗磁珠两次。清洗过程同上。 13. 向含磁珠的EP管中加入20ul 10mM Tris-HCl