C6-2 PCR技术与应用.pdfVIP

6.3 PCR扩增未知DNA片段 6.3 PCR扩增未知DNA片段 • 反向PCR • 反向PCR • 利用接头的PCR • 利用接头的PCR • TAIL-PCR • TAIL-PCR 反向PCR 反向PCR （inverse PCR） （inverse PCR） 左侧序列 右侧序列 • 用于扩增已知序列两 • 用于扩增已知序列两 靶序列中没有 侧的未知序列 侧的未知序列 切点的内切酶 巢式PCR （nested 巢式PCR （nested PCR）：也称嵌套PCR， PCR）：也称嵌套PCR， 是指在PCR完成后，以 是指在PCR完成后，以 PCR产物为模板，根据引 PCR产物为模板，根据引 物内侧的序列设计新引物 物内侧的序列设计新引物 所做的PCR。 所做的PCR。 目的是为了减少或排除第 目的是为了减少或排除第 一次扩增中出现的非特异 一次扩增中出现的非特异 性扩增。 性扩增。 利用接头的PCR 利用接头的PCR • 根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，从而 扩增已知序列侧翼的未知序列。 平末端 接头3‘末端修饰 不能启动延伸 热不对称交错PCR （thermal asymmetric 热不对称交错PCR （thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR） interlaced PCR，TAIL-PCR） • 利用特异引物和随机引物进行温度不对称PCR， • 利用特异引物和随机引物进行温度不对称PCR， 扩增已知序列侧翼的未知序列。 扩增已知序列侧翼的未知序列。 • 有效地控制随机引物引发的非特异产物的产生 • 有效地控制随机引物引发的非特异产物的产生 嵌套特异引物较 长，高退火温度 随机引物短，低 退火温度 通过控制退火温 度来控制何种引 物占优势扩展 P1/AD P1/P1 AD/AD 半巢式 半巢式 6.4 与反转录相关的PCR 6.4 与反转录相关的PCR • 反转录PCR （reverse transcriptase-PCR, RT- • 反转录PCR PCR ）:先以mRNA/总RNA为模板反转录得到单 先以mRNA/总RNA为模板反转录得到单 链cDNA，然后以单链cDNA为模板进行的PCR反 链cDNA，然后以单链cDNA为模板进行的PCR反 应。 应。 • 反转录所用的引物：polyT;