生化工艺——第八章 电泳.pptVIP

未知蛋白质分子量的测定 基于上述SDS的原理介绍，我们可以利用SDS电泳进行未知蛋白质的分子量测定； 4．醋酸纤维素膜电泳 原理：以醋酸纤维素膜为支持介质，其电泳原理与纸电泳基本相同。 与纸电泳相比优点是： 对蛋白质样品的吸附作用极小，几乎完全消除纸电泳中经常出现的“拖尾’观象，染色后背景清晰，分离带狭窄清楚，因而提高了定量测定的精确性。 分离速度快、电泳时间短 样品用量少、灵敏度高 某些用纸电泳不易分离的蛋白质，例如溶菌酶、胰岛素、组蛋白等，经醋酸纤维素膜电泳后能得到很好地分离。 醋酸纤维素膜的电泳图谱经过透明液处理后可使膜质透明化，从而有利于光吸收扫描测定和膜的长期保存。 5、等电点聚焦（isoelectrofocusing）, IEF 等电聚焦是利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH值下蛋白质呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离的方法。 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。常用于同工酶分离、分析、pI 测定 工作原理 蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该蛋白的等电点（isoelectric point pI）。 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析 载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理 载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。 等电聚焦分离示意图 载体两性电解质和pH梯度的形成 等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立 载体两性电解质的概念： 应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置； 应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。 一般采用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸 用于等电聚焦的主要载体两性电解质 Ampholine(瑞典LKB公司) 由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成，它们具有连续改变的氨基与羧基比 Servalyte (德国Serva 公司) 产品Biolyte Pharmalyte (瑞典Pharmacia 公司) 产品分为九种pH范围 IEF特点 受溶质扩散影响小，IEF可消除分子扩散引起的分离度下降。 两性电解质的加入对产品产生污染； pH梯度稳定性不高； 操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象； * * * * * * * * * * * ββ * * 第八章 电泳技术 Electrophoresis 第一节 电泳基本原理 第二节 电泳及其应用 学习目标 了解电泳的分类及各种电泳方法的应用特点； 熟悉各种电泳方法的基本原理； 能利用电泳对生物物质进行分离分析。 第一节 电泳基本原理 电泳 带电荷的粒子在直流电场作用下，向符号相反的电极移动的现象。 电泳分离 利用带电荷粒子在电场中泳动速度的差别进行分离的方法，称为电泳分离。 电色谱 电泳与色谱原理相结合可以派生多种复合分离方法 电泳色谱(electrophoretic chromatography) 将溶质的电泳迁移与色谱分离相结合 电色谱(electrochromatography) 利用电渗作为驱动流动相流动，分离作用源于溶质在固定相和流动相间的分配平衡特性 一、基础理论 1、简单原理 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。 电解质在电场中运动 ＋ － 阴离子 阳离子 二、影响电泳迁移速率的因素 推动带电粒子运动的力F与溶质的净电荷数Q与电场强度E的乘积，其表示为 荷电溶质在自由溶液中与介质的摩擦阻力服从斯托克斯定律 当粒子以稳态运动时，两力之间达到平衡后， 电泳迁移率是指在单位电场强度(1伏特/米)时的泳动速度，即： 实际过程中影响电泳迁移率的因素很多，可以分为以下三大类： (1)与被动离子(或粒子)本身的特性有关 (2)环境因素 (3)所加电场的特性 这些因素在实验过程中要充分注意，尽量保持条件恒定不变，以便获得可重复的结果。 第二节 电泳及其应用 一、电泳的分类 根据电泳原理分类 区带电泳； 移界电泳； 等速电泳； 等电