PI3K%2fAkt、aPKC-%2cι%2fζ--Nrf2调控γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达.pdf

鼠气管上皮细胞Y．谷氨酰半胱氨酸合成酶表达 研究生江刚 导师戴爱国教授 中文摘要 目的：研究浓度为10％的香烟烟雾提取物(CSE)在不同时期对大鼠气管上 factor—E2related 不典型蛋白激酶Cl／‘(aPKC．／‘)、Nrf2(Nuclear factor) aPKC I／‘、Nrf2和核转位的影响及对Y—GCS表达调控在氧化／抗氧化机制中的作用。 探讨P13K特异性抑制剂LY294002、aPKC 诱导的氧化应激情况下对大鼠气管上皮细胞Nrf2核转位和Y-GCS表达调控，阐 的激活和核转位及对Y-GCS的表达水平和活性的影响在氧化／抗氧化机制中的作 用。 方法：实验共分两部分。将体外培养的气道上皮细胞用含20％FCS的DMEM／ P13K aPKC 特异性抑制剂LY294002和／或3uM 察香烟烟雾在不同时期、P13K特异性抑制剂、aPKC．，；特异性抑制剂对大鼠气管上 皮细胞Nrf2核转位及y—GCS的影响；用免疫荧光及Westernblot方法观察Nrf2 核转位和胞浆、胞核蛋白质表达，免疫细胞化学、Westernblot方法检测Y-GCS 的表达水平；逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)方法分析Y-GCSmRNA表达水平； 流式细胞技术、Western blot方法分析p-Akt蛋白质表达水平和阳性细胞比率； Western blot方法检测aPKCI／‘蛋白质表达水平；参照Tietze方法测体外培养气 3 管上皮细胞还原型谷胱甘肽(GSH)的含量；参照双酶法测体外培养气管上皮细胞 Y-GCS的活性。 结果： 第一部分： 常水平(PO．05)。 2．Nrf2在对照组、CSEl2h组主要表达在胞浆，然而，在CSElh、3h、6h组 胞核蛋白质高表达，与对照组比较，均有显著性差异(PO．05)，但各组间表达无 无明显差异，但与对照组比较，均有显著性差异(P0．05)。 达高峰，两组与对照组比较差异显著(P0．05)，6h降低，与对照组比较差异显著 然后逐渐减少，6h恢复正常，12h维持低比率。 4．P—aPKC CSEl2h组表达低水平，与对照组无明显差异(P0．05)。 性lh开始增强，3h明显增强，6h达最高水平，12h表达减弱，与对照组比较无显 著性差异(P0．05)。Y—GCS蛋白质在对照组气管上皮细胞胞浆中呈弱阳性表达， 达。 I／‘与Y—GCS、 Y-GCS活性、p-Akt及Nrf2成正相关(P0．05)。 4 第二部分： 1．当预先予以P13K特异性抑制剂LY294002和／或aPKC l／‘特异性抑制剂 组高，有显著性差异(PO．05)，三组抑制剂组之间无显著性差异(P0．05)。 显著性差异(PO．05)。 呈强阳性表达。 4．在LY294002组，p-Akt蛋白质和P—aPKCl／‘蛋白质都低表达，在R0-31-8220 性细胞比率降低，在RO-31—8220组，表达p-Akt阳性细胞比率增高。 结论： 1．香烟烟雾调节Y-GCS表达和GSH合成。 2．体外培养的气管上皮细胞经香烟烟雾提取物处理后的一定时期Nrf2发生 核转位，说明在氧化应激情况下，Nrf2可能是调控Y-6CS表达的关键转录因子。 l／‘--Nrf2信号 通路可能参与对Y-GC