构建重组系统分析回文结构对基因表达影响.pdfVIP

期 张 锐等：构建重组系统分析回文结构对基因表达的影响 !; ! 两个拷贝 回文序列插入可以有效抑制 基因在大肠杆菌中的表达 ! # $#% !# !#$ 回文结构序列末端添加磷酸基团后，插入$%’() 质粒的! # 位点，所获得的重 组子与$*’+,-$./ 质粒共转化大肠杆菌，出现两种完全不同的情况：一类与$%’() 及$%0 ’()!1 共转化的质粒电泳图谱相似，在$*’+,-$./ 质粒带之前，仍然有大小与$*’+,-$ 相 同的质粒带，说明$% 基因的表达未被抑制，测序证明这类质粒与$%’()!1 相同，只含有 单拷贝的!#$ 回文结构序列；另一类则不同，在$*’+,-$./ 质粒带之前，大小与$*’+,-$ 相同的那条质粒带消失了（图20!3 4 ! ），说明+,-$ 位点不再被切割，因而也就说明在这种 情况下， 基因的表达被抑制了，测序证明这类质粒含有两个拷贝的 回文结构序 $% !#$ 列，命名为$%’()!# 。这种方式插入，形成的回文序列实际长度为5#$，其转录的单链 如果回折，则可以形成一段长为 的双链结构（图 ）。从 基因的表达受抑制 67. !2#$ 8/ $% 这一结果来看，在这种情况下，转录产生的单链67. 可以有效回折，形成一段较稳定的双 链结构，阻碍核糖体向前移动，从而有效地抑制下游基因的表达。 ’ 讨论 一般地，确定某个基因表达与否需要检测这个基因的表达产物，如果是酶基因，需要 将酶提取纯化后确定它的活性，活性不易检测的表达产物，还需要通过抗原 抗体免疫反 9 应，才能判断它表达与否。本文构建了 质粒系统，将含有 基因的质粒与含有 ’()0+,-$ $% 两个同向+,-$ 序列（中间含一段:7. 序列）的质粒同时转化大肠杆菌，在共转化成功的菌 株中， 基因如果表达了，就会切割另一个质粒上的 序列，使其释放掉中间的 $% +,-$ :7. 序列，自身环化成一个小质粒。根据质粒电泳图谱上是否出现小质粒带以及出现的小质 粒带的强弱，就可以很直观地判断细胞内 基因是否表达以及表达水平高低的大致情 $% 况。利用这个系统，通过观察顺式作用元件和反式作用因子对 $% 基因表达的影响，可以 很方便地研究这些作用因子对细胞内基因表达的效应，而不需要体外进行其酶活测定。 本文利用这个系统对回文结构的长度与基因表达的关系进行了初步的研究，并获得了较 好的结果。重组系统构建成功，为今后更方便地分离、克隆表达调控元件，研究基因表达 打下了基础。 回文结构序列与基因表达存在密切的关系。在增强子中出现的回文结构序列一般有 ［ ］ 利于调控基因表达的反式作用因子与之结合，从而促进基因表达2 4 8 ；在终止子前出现的 ［］ 回文结构序列有利于 ; 67. 聚合酶 从:7. 模板上脱离下来，从而有效终止转录过程 。