第二章 酶与细胞固定化.pptVIP

第二章 酶与细胞的固定化 引 言 酶是一类由生物细胞产生的具有催化功能的蛋白质。 酶参与生物体内的各种代谢反应,而且反应后其数量和性质不发生变化。 高效率 高度专一性 可调控性 反应条件温和 广泛应用于酿造、食品、医药等领域 酶对环境十分敏感 物理因素：温度、压力、电磁场 化学因素：氧化、还原、有机溶剂、金属 离子、离子强度、pH 生物因素：酶修饰和酶降解 反应速度逐渐下降 反应后不能回收 对于现代工业来说,酶还不是一种理想的催化剂 怎样才能获得理想的生物催化剂? 答案： 固定化酶 固定化细胞 第一节 酶的固定化 ? 固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反应后的酶可以回收重复使用。 固定化酶的优点 ①极易将固定化酶与底物、产物分开; ②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应; ③在大多数情况下,能够提高酶的稳定性; ④酶反应过程能够加以严格控制; ⑤产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺; ⑥较游离酶更适合于多酶反应; ⑦可以增加产物的收率,提高产物的质量; ⑧酶的使用效率提高,成本降低。 固定化酶存在的缺点 ①?固定化时,酶活力有损失; ②增加了生产的成本,工厂初始投资大; ③只能用于可溶性底物,而且较适用于 小分子底物,对大分子底物不适宜; ④与完整菌体相比不适宜于多酶反应,特 别是需要辅助因子的反应; ⑤胞内酶必须经过酶的分离手续。 二、固定化酶的制备原则 根据应用目的、应用环境，选择固定化的方法 ，都要遵循以下基本原则 ： ①必须注意维持酶的催化活性及专一性。 ②固定化应该有利于生产自动化、连续化。 ③ 固定化酶应有最小的空间位阻 ④酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于反复使用。 ⑤固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 ⑥固定化酶成本要低,以利于工业使用。 三、固定化方法 酶的固定化方法很多,但对任何酶都适用的方法是没有的, 必须经过实验研究才能确定。 (一)非共价结合法 1.?结晶法 使酶结晶从而实现固定化的方法。 2.??分散法 通过酶分散于水不溶相中从而实现固 定化的方法。 3. 吸附法 （1）物理吸附法 利用氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载体上。 无机吸附剂：高岭土、皂土、硅酸、氧 化铝等 吸附量小、有些酶发生吸附变性 有机吸附剂： 大孔树脂、葡聚糖凝胶、纤维素衍生物、胶原等 吸附量略大(～50mg/g载体),不产生变性失活。 比较受重视。 （2） 离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。 CM -纤维素、DEAE-纤维素 吸附量 50--150mg/g 优点： 操作方便,条件温和,可再生后反复使用 缺点： 结合力较弱,不适宜的pH,高盐浓度,高底物浓度,高温等往往能把吸附的酶解析下来。 可以改善方法： 1.选择最佳条件操作（如温度、pH） 2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量， 3.采用高酶量吸附 4.开发新载体 5.对酶进行修饰后再进行交换吸附 (二)化学结合法 1、共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。 分为两类： （1）将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。 ? （2）在载体上接一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。 偶联成功与否取决于： 载体：功能基团，如羟基、芳香氨基， 羧基，羧甲基等 酶分子:侧链非必需基团 （游离的α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg--胍基 C-COOH, Asp—γ--羧基，Glu---羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团不会直接反应，其功能基团要活化。 1)重氮化 芳香氨基载体 方法特点： 载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，再在温和条件下和酶分子上相应基团直接偶联。 如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶的固定化，偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃时，得到固化酶具很高酶活性 2） 溴化氰-亚氨碳酸基反应 带羟基的载体在碱性条件下，载体的羟基和溴化氰反应，生成活泼的亚氨碳酸酯衍生物，在弱碱中直接和酶的氨基进行共价偶联。 最后一种是主要产物。 此方法固