雷公藤内酯醇诱导骨髓增殖性疾病细胞凋亡及其机制与研究.pdfVIP

{，IlJ人学颁I：论文 雷公藤内酯再享诱导骨髓增殖性疾病细胞列亡及其机制研究 雷公藤内酯醇诱导骨髓增殖性疾病细胞凋亡 及其机制研究 Jak2V617F突变细胞发生凋亡 专业： 病理学与病理生理学 硕士生：陈琦 导师：潘景轩教授 中文摘要 I背景I Janus激酶位于胞浆内，通过与胞膜表面受体耦联激活信号，介导细胞内的各种生物 学反应，主要包括细胞的增殖，分化，免疫反应及红细胞生成作用【l】。Janus激酶与 细胞表面受体结合后，会引发其下游信号传递与转录激活因子家族(Stats)的磷酸化 及二聚体化，二聚体形式的StatFh胞浆进入胞核，从而启动一系列生物学反应【2】。 其中，由l132个氨基酸构成的Jak2激酶主要在骨髓细胞的增殖与分化中发挥重要作 用【3】。 位的缬氨酸(V)错义编码为苯丙氨酸(F)，而这种功能获得性点突变可以导致Jak2 酪氨酸激酶的持续性激活【2．9】。敲除Jak2基因的小鼠12．5天后，由于红细胞生成 障碍而出现胚胎死亡[10，l l】。对PV病人用siRNA的方式沉默Jak2表达会明显抑制 病人造血干细胞非红细胞生成素依赖性增殖(EEC)【12]。转基因小鼠实验的直接 t巾山人学硕I：论文 雷公藤内酯醇诱导骨髓增殖性疾病细胞凋亡及其机制研究 患者中均发现Jak2V617F的突变。此三者均属于MPD，且发病率明显高于同属于 MPD的慢性粒细胞性自血病(CML)。这些骨髓增殖性疾病的特点是造血干细胞， 祖细胞无性克隆性转化和一种或几种血细胞增殖。PV主要表现为红细胞异常增多， ET主要表现为血小板特异性增高，而PMF表现为骨髓纤维化的同时伴有血细胞的 异常增牛或减少[15】。 鉴于MPD目前仍无法治愈，Jak2V617F突变的发现可能为该病提供一个新的治 XL019目前已用于I期临床治疗MPD病人【7】。尽管这些酪氨酸激酶抑制剂可特异 因耐药的可能性，因此，人们试图研究通过其他途径完善治疗的效果。例如最近发 现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂和热休克蛋白90(HSP90)抑制剂即可通过降低Jak2 [20·23】。 TPL是由中草药雷公藤中提取的活性化合物，其抗肿瘤效应主要是通过抑制 RNA聚合酶的活性而发挥作用[21．231。本课题探讨了该化合物是否可以通过下调 提供理论依据。 【方法1 1．HEL细胞体外培养 Western 2． blot检测TPL对Jak2及其下游信号转导通路的表达及磷酸化影响， 对其他凋亡相关蛋白表达的作用 3． 半定量RT-PCR检测药物对Jak2mRNA表达水平的影响 4． 软琼脂克隆形成实验和台盼蓝拒染实验测定TPL对HEL细胞的增殖抑制 Ⅱ q，山人学硕f：论文 雷公藤内酯酊诱导骨镟增吼性疾病细胞凋亡及其机制研究 作用 5． 流式细胞术测定药物对细胞凋亡和细胞周期的影响 6． 小分子RNA干扰技术检测Mci．1对TPL诱导HEL细胞凋亡的影响 7． 构建HEL细胞裸鼠荷瘤模型及药物处理 【结果l 1．TPL下调Jak2 mRNA水平并抑制携带Jak2V6l7F突变的HEL细胞增殖： Westem 水平均发生明显下调，同时RNA聚合酶的蛋白水平也呈浓度和时问依赖性 下调；软琼脂克隆形成实验测定TPL抑制HEL细胞增殖的IC50约为2．6nM。 2．TPL呈浓度和时问依赖方式下调Jak2下游信号转导分子的表达和磷酸化水 h，Westernblot 平：0—50nM药物处理细胞48h或50nM药物处理细胞0至48 结果显示其下游信号转导分子Stat3、ErkI／2、Akt的表达和磷酸化水平均明 显卜调，并呈浓度和时间依赖方式。 3．TPL诱导细胞凋亡，呈浓度和