国家自然科学基金课题设计和申请书撰写.pptVIP

* 1、候选miRNA在中枢神经系统发育过程中的表达。利用miRNA提取和反转录系统明确候选miRNA在不同胎龄小鼠的相关脑区的时空表达特征；利用LNA修饰的寡核苷酸探针进行原位杂交（Kloosterman, W.P. et al. 2006, Nat. Methods. 3, 27-29），在体检测候选miRNA在中枢神经系统内的时空表达情况。 2、候选miRNA对NSC增殖分化的调控作用。利用生物合成的miRNA mimics和inhibits分别转染神经细胞系细胞和培养的原代神经球（Sathyan, P. et al. 2007, J. Neurosci. 27, 8546-8557），初步观察候选miRNA对NSC增殖分化等生物学行为的影响；利用病毒感染体系构建含有EGFP的针对候选miRNA的过表达载体，以及反义序列的表达载体，感染原代培养的神经球，观察NSC增殖分化等细胞生物学行为的变化；用胚胎电转染的方法将上述过表达载体和反义载体转染至不同阶段小鼠胚胎的室管膜（下）带，结合NSC增殖分化相关的标记物的免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察被转染的NSC的变化。 研究内容： 3、候选miRNA调控NSC增殖分化的分子机制。首先探讨差异表达的miRNA与Notch信号的关系，主要研究这些差异miRNA是否是Notch信号途径的下游分子，包括其启动子区的生物信息学分析（RBP-J或Hes家族识别序列的存在与否），以及用体外和体内实验方法证实这些miRNA的表达是否受Notch/RBP-J信号的调控。其次是借助生物信息学方法分析miRNA靶分子，并综合使用Luciferase报告基因实验、基因转染和定量RT-PCR、定位突变等方法分析miRNA对靶分子的调控作用，再根据靶分子的特征进行更加深入的分子机制的研究。 4、体内验证Notch途径和候选miRNA之间的调控关系。对于经过分子水平验证的miRNA，用过表达或是抑制表达的病毒载体来感染RBP-J剔除胚胎小鼠，观察我们前期观察到的NSC增殖分化异常(Gao F, et al. Mol Cell Neurosci. 2009, 40: 442-450)是否能够被挽救，以验证Notch途径和候选miRNA两者在体内的调节关系。 研究内容： 拟解决的关键科学问题： （1）什么是自己研究的领域的关键科学问题？为什么？ （2）本研究解决这个问题的逻辑思路是什么？解决这个问题有何意义？ 本课题拟回答的关键科学问题：本课题拟回答的根本科学问题是Notch信号调控NSC增殖分化的分子机制问题。文献报道和我们的前期工作得出了Notch信号调控NSC的一致结论，但进一步的分子机制是有待回答的进一步问题。而Notch通路和miRNA分子在NSC发育过程中都发挥着重要的作用，但是他们之间是否存在cross-talk？如果有，各自在调控网络中又分别扮演着什么角色？两者之间是如何相互影响相互调控的？这种相互调控最终对NSC的增殖分化又会是怎样的影响？这些调控和调控间的相互作用可能贯穿着神经系统发育的全过程。阐明这些调控因素之间的相互作用，不仅对于我们理解NSC发育的基本过程有着重要的意义，而且对于我们将来利用NSC进行疾病治疗也具有至关重要的意义。本课题前期通过miRNA芯片在Notch途径阻断的小鼠中检测到一组发生改变的miRNA分子，我们拟在此基础上重点观察Notch途径对miRNA的调控，以明确这两个在NSC发育过程中都十分重要的因素之间的相互作用，以及他们的相互作用对于NSC增殖分化的调控。 课题设计的原则 对照原则： 医学研究主要是通过对比实验组和对照组的差别来回答干预因素的效应，所以完美的对照组设计十分重要 重复原则： 医学研究是设计的实验，差别的真实性需要经过统计学检验，所以保质保量的重复实验是发现真理的保证 拟采取的研究方案及可行性分析 （包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明） 研究方法：用xxx观察分析xxx；用xxx观察分析xxx；…… 技术路线：最好图示一个总体技术路线 实验研究方案：结合技术路线，把研究内容里的各项实验具体化（步骤、分组、……对照、重复） 关键技术说明：课题可能遇到的技术难点，需加以说明 常见问题： （1）技术路线图太复杂 （2）研究方案与研究内容不吻合，只是简单地罗列方法和Protocol （3）研究方案过于繁琐或过于简单，尤其是过分简单 （4）方案不完善甚至出错：该做的实验没有写；用人组织样品杂交小鼠芯片；购买某公司的试剂，而该公司已倒闭；写的是别的课题的方案；…… （5）关键技术需要说明：基因剔除小鼠；关键抗体；…… 可行性分析： （1）理论可行性 （2）条件可行性 （3）研究基础可行性、…… 1）miRNA靶基因的筛选将可能是本课题面