铜对wnt6 基因表达及鹅羽绒生产性能影响与试验方法.docVIP

铜对wnt6基因表达及鹅羽绒生产性能影响的试验方法 赵明 (吉林农业大学动物科学技术学院 长春 吉林 130118) [摘要]本文以吉林白鹅为研究对象，饲喂不同添加量铜日粮，结合Wnt6基因表达测定试探讨铜对鹅羽绒的促生长作用，重点介绍试验设计和试验方法，并提出试验难点和试验预期。 [关键词]铜 羽绒生产 Wnt6基因表达 试验方法 前言 铜是人类历史上最早使用的金属，铜大量存在于各种岩石和矿物中，自然界中铜以CuO、Cu+、Cu2+二种氧化态形式互相转化。在生物体中，铜是最基本的微量营养元素之一，大量研究表明[1，2]，铜至少存在于30多种酶中，铜通过多种酶参与机体的代谢、氧化磷酸化、自由基解毒、黑色素合成等过程，并能维持组织细胞的稳定性。在动物生长发育，免疫功能等方面有重要作用[3，4]。自20世纪80年代以来，铜一直作为一种有效的促生长剂在畜禽养殖中被广泛利用，高剂量铜己被认为是一种高效、廉价、使用方便的促生长剂。然而，不少的饲料添加剂厂家、畜禽养殖生产者为了追求效益，在饲料中盲目添加高铜，造成了畜禽铜中毒、亚临床中毒的发生。2004年1月，欧盟法规限制了饲料中铜的添加量标准，鹅最大耐受量100mg/kg[5,6]。　 鹅羽绒品质和产量是一类非常重要的经济性状，，，Wnt/β-catenin信号传导途径是调控毛囊形态发生和生长的核心通路，，，，Wnt基因[9]选取Wnt6做基因表达试验，试探讨不同日粮铜添加量对鹅羽绒的促生长作用，以供有关专业同学参考，下面介绍实验方法。 1.材料与方法 1.1试验动物 从100只20—25周龄吉林白鹅中随机选取24只，分为4组，每组6只，分别编号，称体重，采用翻肛鉴别性别。 1.2技术路线 注示： CK（对照组）：试验日粮0mg/kg铜添加量。 T1（试验一组）：试验日20mg/kg铜添加量。 T2（试验二组）：试验日50mg/kg铜添加量。 T3（试验三组）：试验日80mg/kg铜添加量。 附：不同Cu添加量日粮配置方法 先根据整个试验期计算好基础日粮的总体饲喂量，根据下图配方配好基础日粮，再根据各试验组不同的Cu添加量计算出每组试验日粮的CuSO4.5H2O需要量，研磨成极细的粉末后采用逐级预混的方法配置，最后用混料机混合10分钟以上，以保证Cu充分混匀，防止部分饲料中Cu含量超标，引起铜中毒。如果是夏天可以采用喷雾法配置，这样保证铜混合充分均匀，但要及时对试验日粮进行干燥处理，防止其受潮霉变。 1.3基础日粮配方 1.4 饲养试验 饲喂：第一次上料给水，8：00，只鹅给料量 100—150g；第二次上料给水，12：00，只鹅给料量 100—150g；第三次上料给水：16：00，只鹅给料量 150—200g。 要求：（1）每天早晨上料前要清除前一天剩余饲料，并称重。（2）每天早晨要清洗饮水器，然后一天三次加注净水。（3）打扫卫生、消毒：每天早晨饲喂前清除舍内粪便，清除的粪便堆积到指定地点，鹅舍每周消毒1—2次。（4）记录：试验期间（包括试验准备期、预试期、试验期、试验后处理）。 1.5 试验方法 1.5.1拔毛部位划分 背部，包括颈部以后，翅膀与骼骨联线以上的部位；胸部，在背部以下，后面以龙骨剑突为界；腹部，龙骨剑突以后，骸骨与坐骨联线以下的部位[10]。 1.5.2拔毛和采血 1.5.2.1预试期(15天)结束后第一次拔毛，测量羽毛相关数据。试验期(45天)结束后第二次拔毛，测量羽毛相关数据。 1.5.2.2 羽绒生长性状的测量方法 测量绒朵长：用千分卜尺量取绒朵根部至尖部长度。 测量绒朵羽小枝的细度：将绒朵制成游离纤维玻片标本，用显微纤维投影仪测每根羽枝的直径，个个体每个部位测定50根羽小丝。 测量千朵重：在每个部位随机抽取1000个绒朵用力分之电子天平称重。 测定自然含水量：自然含水量(%)=原毛重量(g)-绝对干燥羽毛重量(g)/原毛重量(g)×100 测定耗氧指数：耗氧指数(氧的毫克数/100克试样)=8×100 (A-B)N。 测定含脂率：含脂率(%)=(抽提后+包重)-(抽提前十包重)/试样重。 附：鹅活体拔毛的方法： 先给要拔绒的鹅用10ml注射器灌喂20ml高度白酒，观察3-5分钟后，等鹅反应迟缓后再进行拔绒，可以使鹅比较老实便于拔绒，酒精也可以使毛孔扩张方便拔绒，防止拔断绒毛，保存绒朵完整。 1.5.2.3 采血：分离血清，检测不同铜含量对血液乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、铜蓝蛋(CP)、谷胧甘肤过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)活性的影响[11]。 采集皮肤、提取毛囊RNA：分析不同剂量的铜对wnt6基因mRNA相对表达水平。 1.5.3实验室线图 采样→提取RNA→OD