第四节免疫金（银）组织化学技术.pptVIP

第四节　免疫金（银）组织化学技术 1、原理　免疫金（银）组化染色技术是金颗粒标记的抗原（抗体）与相应的抗体（抗原）特异性结合后，在银显色剂的作用下，标记物上的金颗粒起液化作用，使显影液中的硝酸银离子还原成银原子沉淀，在抗原抗体复合物的金颗粒周围形成一个逐步增大的黑色“银壳”，由于金颗粒的液化作用，更多的银离子被还原，最后使抗原位置放大，从而提高镜下的可见度。 2、操作步骤 3、方法评价 第十三章免疫细胞分离及检测技术 　　　　 第一节 免疫细胞的分离　　进行有关细胞免疫方面的检测，特别是有关免疫细胞功能的体外实验，往往须将待检淋巴细胞从血液或组织中分离出来，而外周血会有多种细胞成分，包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。 外周血单个核细胞（periphetal blood mononuclear cells，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核粒细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075－1.090，血小板为1.030－1.035。因此利用一种介于1.075－1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心。使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。为使沉浮速度加快，一般要作离心分离， 　　从上可以看出，分离溶液是分离各类细胞的关键，对分离溶液的基本要求是：①对细胞无毒； ②基本等渗；③不溶于血浆等分离物质；④有一定的比重。聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，商品名为ficoll，分离人外用血淋巴细胞以密度为 1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076－1.090之间。常规的单个核细胞分离液由 2份6％聚蔗糖蒸馏水溶液＋1份34％泛影葡胺生理盐水溶液组成，其比重为1.077 ±0.002。 　Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图13－1）。本法分离的单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％－95％，细胞收率可达80％以上，但室温超过25℃时可影响细胞收率。 （一）贴壁粘附法　　利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶中，至37℃温箱静置lh，单核细胞和粒细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。如继而用橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞群。但因B细胞也有贴壁现象，采用本法分离到的淋巴细胞群中B细胞会有所损失。可调整静置时间控制细胞的收率和纯度。 （二）吸附柱过滤法　　同样利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶 Sephadex G10的层析柱中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。已知有关细胞的粘附能力为：巨噬细胞或单核细胞＞树突细胞＞B细胞＞T细胞＝红细胞。可以通过控制柱体和洗脱条件获得有关细胞。此法对细胞的损害较小。 （三）磁铁吸引法　　利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内，不时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬铁颗粒后，将磁铁置于管底，单核细胞将被吸引，上层液中即为较纯的淋巴细胞。（四）Percoll分离液法　　Percoll分离液法是一种连续密度梯度离心分离法。 （一）E花环沉降法　　此法的基本原理是利用T细胞有羊红细胞受体（E受体），可以与羊红细胞结合形成较大的E花环的特性，可将T细胞和B细胞分离。将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继而用淋巴细胞分层液分离，浮悬在分层界面的细胞群则富含B细胞，而T细胞由于与羊红细胞结合形成E花环后比重较大，则沉降在管底。 （二）尼龙毛柱分离法尼龙毛（nylon wool）即聚酰胺纤维。该法是利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，将T和B细胞分离。 1、分离细胞的保存 　在通常的情况下，分离所得的细胞需要加以适当的保护，否则活力将迅速下降，甚至死亡。2、细胞活力测定　 细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的大小对以后的试验结果有很大的影响。 * 免疫胶体金标记的原理 胶体金是氯金酸（HauCl4）在还原剂如白磷、维生素C、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成