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脂肪酸甲酯谱图分析方法及其在 微生物学领域的应用( 王秋红1,2，蓝江林1、朱育菁1、肖荣凤1，葛慈斌1，林营志1，陈亮2，刘波1* （福建省农业科学院生物技术研究所，福州 350003厦门大学生命科学院，厦门 36）脂肪酸Fatty Acid Methyl Ester, FAME）是鉴于脂肪酸可作为生物标记物而发展起来的分析技术。本文介绍了FAME谱图分析方法及其在微生物学领域的应用，包括在微生物检测、鉴定和微生物多样性研究中的应用。 关键词：FAME谱图分析；GC/GC-MS；微生物鉴定；微生物多样性 中图分类号： 文献标识码：A脂肪酸是生物体内不可缺少的能量和营养物质，是生物体的基本结构成分之一，在细胞中绝大部分脂肪酸以结合形式存在，构成具有重要生理功能的脂类，它是构成生物膜的重要物质；是机体代谢所需燃料的贮存形式；作为细胞表面物质与细胞识别、种族特异性和细胞免疫等密切[1,2]；具有结构多样性和高的生物学特异性，是特别有效的生物标记物[3]。目前脂肪酸作为一类重要的生物活性物质，已经引起了国内外学者的极大重视。 脂肪酸甲酯（Fatty Acid Methyl Ester, FAME）谱图分析方法是鉴于脂肪酸可作为生物标记物而发展起来的分析技术。FAME谱图分析方法是在细胞组分水平上研究微生物的重要技术，通过分析微生物细胞膜上磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid, PLFA）的组分来鉴定微生物的种属、分析微生物多样性，是一种简便、可靠的分析方法。由于用于FAME谱图分析的脂肪酸多为磷脂脂肪酸，所以该方法又称为PLFA谱图分析方法。 1 FAME谱图分析的原理与方法 1.1 原理 FAME谱图分析方法的原理是基于脂类几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分,不同微生物体内往往具有不同的磷脂脂肪酸组成和含量水平，其含量和结构具有种属特征或与其分类位置密切相关，能够标志某一类或某种特定微生物的存在，是一类最常见的生物标记物[3,4,5]。但是古生菌不能使用FAME谱图进行分析,因为它的极性脂质是以醚而不是酯键的形式出现[6]。此外,磷脂不能作为细胞的贮存物质,一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物就会马上消失,因此，磷脂脂肪酸可以代表微生物群落中“存活”的那部分群体[7]。 1.2 方法 FAME谱图分析首先要提取出磷脂脂肪酸，即利用有机溶剂将样品中的脂肪酸浸提出来，然后进行分离纯化，将磷脂脂肪酸甲基化转化成脂肪酸甲酯，最后利用标记脂肪酸，通过气相色谱等仪器分析，得到样品的磷脂脂肪酸组成图谱，进而得到不同脂肪酸的含量和种类，即所谓的FAME谱图（图1）。根据谱图中脂肪酸甲酯的多样性，利用相关的数据库和相关的计算机分析软件，便可鉴定出样品中微生物的种类或得到样品中微生物群落结构组成多样性、比例以及微生物生物量等方面的信息。对于该研究，主要是通过气相色谱（Gas Chromatography, GC），以及气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrum, GC-MS）联用实现的，由于脂肪酸本身挥发性较小，所以要将脂肪酸甲基化转化成脂肪酸甲酯以增加脂肪酸的挥发性，供GC或GC-MS分析利用。 图1 FAME谱图分析的一般流程 Fig.1 The general procedures of FAME fingerprint analysis FAME谱图的形成是源于样品中微生物的组成和生物量的多少，生物体内细胞中磷脂的含量通常可认为相对显著恒定[4]。不过,磷脂含量并非绝对不变，例如温度的变化就会影响膜脂。温度的增加会带来磷脂双分子层流动性的增加，这会导致形成磷脂非双分子层相,进而影响细胞膜的渗透性。磷脂脂肪酸成分发生适应性变化以改变膜的流动性变化是生物体内消除这些影响的机制之一，在细菌中常常通过增加不饱和脂肪酸的含量来调节膜脂的变相温度以维持膜脂的流动性[8]。营养状况的变化也有可能改变磷脂的含量，有学者对此进行了相关研究[9]，不过目前还很少见到这方面的报道。总之，脂肪酸是一种可随着培养环境的变化发生改变的细胞成分，因此分析过程的条件选择和质量控制则显得非常重要。 2 FAME谱图分析方法在微生物学领域的应用 2.1 FAME谱图分析方法在微生物鉴定中的应用 目前所知道的微生物已经超过了十万种，这还是一个正在急剧扩大着的数字[10]。快速、准确鉴定微生物日益成为临床、环境和工业领域的迫切需要。DNA水平。在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标尚停留在细胞的形态和习性水平，从本世纪60年代起，后三个水平的分类鉴定理论和技术开始发展。脂类是最常见的生物标志物，现代微生物学研究表明：微生物细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与微生物DNA具有高度的同源性，各种微生物具