高效液相色谱法测定红细胞膜表面受体配体结合量.docVIP

DOI：10.3724/SP.J.1096.2010.0000 高效液相色谱法测定硫酸特布他林与 红细胞膜表面2肾上腺素受体结合量 蒋心惠，周岐新* (重庆医科大学药学院 重庆 400016) 建立了高效液相色谱同时检测红细胞混悬液中硫酸特布他林与盐酸普萘洛尔的方法。红细胞与特布他林37℃水浴振荡保温反应1 h后，没有与细胞膜受体结合的特布他林通过1500 r/min 离心5 min 后分离，取上清液与受体-药物复合物分离。色谱柱为C18柱，以0.020 mol/L KH2PO4（含0.25％三乙胺，pH 5.1 ) 甲醇20: 80 , V/V) 为流动相，在荧光激发波长280 nm，发射波长320 nm处测定样品含量。在优化的条件下，特布他林与普萘洛尔在0.010～3.000 mg／L范围内线性关系良好，相关系数分别为0.9999和0.9998。测定重复性相对标准偏差为0.8％和1.2％；检出限分别为1.0和3.0 gL。该方法安全、简便、灵敏，适用于测定红细胞中硫酸特布他林和受体配体结合实验的研究。关键词 硫酸特布他林盐酸普萘洛尔红细胞膜2肾上腺素受体高效液相色谱 受体是存在于细胞膜细胞浆或细胞核上的大分子化合物(如蛋白质、核酸、脂质等)，能与特异性配体(药物、递质、激素、内源性活性物质等)结合并产生效应。受体上能与配体相结合的活性基团，称为受点或位点。配体与受体结合是药物发挥临床疗效的基础。肾上腺素受体存在于细胞膜，而红细胞膜表面存在特异的肾上腺素2受体。特布他林是特异性的肾上腺素2受体激动剂，而普萘洛尔为非选择性肾上腺素受体的阻断剂，与肾上腺素2受体亲和力较高。 目前，关于受体与配体的结合情况研究经典方法是放射性受体配体结合[1-3]，即采用已用放射性元素标记的药物与特异的受体蛋白或者含有某类受体的组织共同作用一段时间后，分离未结合的标记药物，测定受体蛋白或者组织的放射性，从而得出受体配体的结合情况[46]。由于放射性元素在检测和后处理时存在环境污染和对人体的伤害。本研究采用对人体无害的兼具有分离与分析功能的高效液相色谱法检测游离药物量。测定结果表明，特布他林与红细胞膜受体的非特异性结合高于特异性结合量。 1100高效液相色谱仪（美国 Agillent公司），配备荧光检测器。Hypersil C18 柱 (250 mm × 4.6 mm ，10 m ，大连伊利特分析仪器有限公司）。 甲醇（色谱纯）；三乙胺、KH2PO4、H3PO4、NaOH(优级纯)；柠檬酸、柠檬酸三钠、葡萄糖、NaCl (分析纯)。实验用水为超纯水。硫酸特布他林和盐酸普萘洛尔购自中国药品生物制品检定所，分别以超纯水配成1000 mg／L 的储备液，临用时根据需要以Alsever液逐级稀释为标准工作液。Alsever液：称取柠檬酸三钠0.80 g ，柠檬酸0.05 g ，葡萄糖2.05 g ，NaCl 0.42 g ，加入超纯水溶解，用H3PO4调至pH 7.40。再加超纯水至100 mL ，高温灭菌后置于冰箱中4 ℃保存备用。 2.2 实验方法 2.2.1 将Alsever液混悬的红细胞0.2 mL （含红细胞1.2×1010个）置于2 mL PE管中，分别准确加入普萘洛尔标准工作液与特布他林标准工作液，或者单独加入其中一种药物，然后补加Alsever液至0.5 mL。混匀，将此混悬液置于37℃水浴振荡保温反应1 h，取出，1500 r/min 离心5 min，吸取上清液0.2 mL，于此上清液中加入等体积的甲醇，用于除去其中可能混有的少量蛋白质成分。混悬均匀，13000 r/min 离心5 min，取上清液待测。 2.2.2 色谱条件 Hypersil C18 色谱柱 (250 mm × 4.6 mm , 10 m )；流动相为 0.020 mol/L KH2PO4溶液（含0.25％三乙胺，pH 5.1 ) –甲醇 ( 20 : 80 , V/V )， 流速为1.0 mL／min；检测器为荧光检测器，检测波长为激发波长280 nm，发射波长320 nm；柱温30℃； 进样量20 L。 3 结果与讨论 3.1 药物与细胞膜受体的反应平衡时间的测定 本实验的目的是测定药物与其特异受体的结合特性，采用正常人体温37℃为反应温度，其达到平衡所需要的时间通过药物与受体的结合程度，也就是含有红细胞膜的Alsever液中游离药物的浓度变化来体现。实验结果表明，保温时间为15，30，60 和90 min 时，游离药物峰面积分别为6253 ，5842 ，5843和5865。 由此可见，特布他林与红细胞膜受体的结合随水浴加热时间的延长而增加，但加热到60 min后结合已达平衡，再延长加热时间，结合率并没有明显增加，所以本实验选用加热60 min