实验六SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定.docVIP

实验六 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定 【实验目的】 1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。 2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。 【实验原理】 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。 SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。 【实验材料】 1.实验器材 微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。 2.实验试剂 ⑴ 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。 ⑵ 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。 ⑶ 10% (w/v) SDS: 取10g的SDS，加蒸馏水至100ml。 ⑷ 50% (v/v) 甘油: 取50ml 100%甘油，加入50ml蒸馏水。 ⑸ 1% (w/v) 溴酚蓝:取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌,直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。 ⑹ A液--丙烯酰胺储备液（配制含30% (w/v) 丙烯酰胺和0.8% (w/v) 甲叉双丙烯酰胺的溶液100ml）在通风柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蜡膜封口，可在4℃存放数月。 ⑺ B液--4×分离胶缓冲液：取75ml 2mol/L Tris-HCl (pH8.8)，加入4ml 10% SDS, 加21ml蒸馏水，混匀，可在4℃存放数月。 ⑻ C液--4×浓缩胶缓冲液:取50ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入4ml 10% SDS, 加46ml蒸馏水，混匀，可在4℃存放数月。 ⑼ 10%过硫酸铵：取0.5g过硫酸铵，加入5ml蒸馏水，可保存在密封的管内，于4℃存放数月。 ⑽ 电泳缓冲液：取3g Tris，14.4g甘氨酸，1g SDS，加蒸馏水至1L, pH约为8.3, 也可配制成10×的储备液，在室温下长期保存。 ⑾ 5×样品缓冲液：取0.6ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入2ml 10% SDS, 5ml 50%的甘油，0.5ml 2-巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水混匀，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。 ⑿ 考马斯亮蓝染液：1.0g 考马斯亮蓝R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸馏水及100ml冰醋酸即成。 ⒀ 考马斯亮蓝脱色液：将100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水混匀备用。 【实验操作】 1.灌制分离胶 ⑴ 组装凝胶模具: 可按照使用说明书装配好灌胶用的模具。对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。 ⑵ 将A液、B液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺(A液中)是神经毒素，操作时必须戴手套。加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。凝胶很快会聚合，操作要迅速。小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡。 ⑶ 当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm)，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1mm～5mm的水层，这使凝胶表