实验十一大肠杆菌的转化.pptVIP

实验十一 大肠杆菌的转化 目的与要求 学习分子遗传学的基本操作。 了解质粒在遗传工程中的重要作用及转化子的筛选方法。 实验原理 所谓转化是指细菌细胞从外界环境中吸收含有某些基因的DNA片段，从而表现出相应性状的现象。细菌细胞不是任何状态下都能吸收外源DNA。它只有处于一种易于接受外源DNA的状态——感受态（competence）时才具备这种能力。分子生物学研究中，利用最多的大肠杆菌，感受态则必须通过物理的或化学的方法进行诱导。 实验原理 通常的做法是在大肠杆菌对数生长的早中期，在0℃条件下用CaCl2处理细胞，并辅之以短时间的热激。感受态细胞吸收DNA的极力尚未明确。天然的转化体系与CaCl2诱发的转化体系有一个很重要的差异：前者需要线性的DNA片段；而后者更多的是吸收环状的DNA。这样我们可以把外源基因连接在质粒DNA上导入到大肠杆菌中。这样，外源DNA不需要与宿主染色体重组，即可随着质粒独立的复制，并表达相应的性状。 实验材料和用品 材料：大肠杆菌 质粒DNA（自己提取） 用品：不加氨苄的LB平板和加氨苄 （100ug/ml）的LB平板 仪器：超净工作台 恒温摇床 低温离心机 试剂：0.1mol/L CaCl2 实验步骤 分3天进行: 第一天制备感受态细胞;(14-16小时) 第二天完成转化; 第三天观察结果。（16小时） 感受态细胞的制备及转化 取处于对数生长期的受体E.coli菌液1-1.5ml。 12000rpm离心30秒钟，弃上清，混匀沉淀物。 加预冷的0.1M CaCl2 1ml,混匀后12000rpm离心30秒钟，弃上清。 加300ul冷0.1M CaCl2及10ul质粒DNA混匀后，冰浴30分钟。 感受态细胞的制备及转化 42℃处理90秒钟。 立即冰浴1-2分钟后加800ul LB培养基。 混匀后37℃振荡培养50分钟。 取100ul培养物涂布于含终浓度100ug/ml Amp的LB培养基上，37℃培养16小时。 次日上午8:00-10:00看转化结果。 实验结果 计算转化率 转化率 =每质粒DNA所转化的大肠杆菌数x100% =菌落数/质粒DNA用量x100% 思考题 什么是转化？什么是转导？两者有什么区别？ 在转化实验中，实验组和对照平皿应有什么样的结果？如何解释这个结果？ * *