青蒿P450cDNA基因的克隆及生物信息学分析.pdfVIP

维普资讯 第32卷第21期 中 国 中 药杂 志 Vo1．32，Issue 21 November，2007 2007年 l1月 ChinaJournalofChineseMateriaMedica 青蒿P450cDNA基因的克隆及生物信息学分析 孔建强，王 伟 ，郑晓东，朱 平，程克棣 (中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所 卫生部天然药物生物合成重点实验室，北京 100050) [摘要] 目的：对青蒿P450cDNA基因进行克隆和生物信息学分析。方法：通过 RT·PCR，从青蒿 cDNA中克 隆了1个P450基因；通过生物信息学方法 ，对其结构特点进行分析。结果：该 P450cDNA基因ORF为 1464bp，编 码488个氨基酸 ，该序列在GenBank上的登录号为DQ667171。编码蛋白是一个中等大小的A型P450，相对分子质 量54．992kDa；等电点8．83，定位于线粒体，和 CYP71AV1具有很高的同源性。结论 ：该青蒿P450和CYP71AV1在 进化和性质上很接近，可能在青蒿中执行类似功能。 [关键词] 青蒿；P450；生物信息学分析；CYP71AV1 [中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]1001-5302(2007)21-2227-05 青蒿ArtemisiaannuaL 是菊科蒿属植物。自 ScriptMTRT．PCRSystem试剂盒购 自Invitrogen公司。 从中分离出创新抗疟药青蒿素后，对青蒿的研究，尤 其他生化试剂均为市售分析纯。 其是青蒿素生物合成的分子生物学研究进入了一个 1．3 青蒿 P450cDNA基因的获得 青蒿总 RNA 快速增长期。许多和青蒿素生物合成相关的基因被 的提取方法参考文献 [5]。提取青蒿总RNA后，利 克隆出来 4。，但其中一部分基因的确切功能未知。 用 Invitrogen公司的ThermoScript RT—PCRSystem， 因此，通过生物信息学手段，对这些基因的结构特点 反转录成cDNA。根据已经发表的青蒿 P450cDNA 进行分析，指导其功能鉴定具有很重要的意义。作 序 列，设计 引物 AR7(AR7：5一GGGATCCATG— 者根据 已经发表 的青蒿 P450序 列 DQ268763 GCACTCTCACTGACCAC．3)和 AR15(AR15：5一 (CYP71AV1) 设计引物，以青蒿cDNA为模板，通 GGTCGACCTAGAAACTTGGAACGAGTAA．3)，以青 过RT—PCR获得了和已经发表的P450序列一致的 蒿cDNA为模板，采用如下程序进行 PCR：95cI=，5 DNA序列。同时还获得 了同源性很高的另一个 min；95cI=，30S，51cI=，1．5min，72cI=，1．5min，30 cDNA序列，GenBank注册号是 DQ667171。利用生 cycles；72cI=，10min，扩增得到 1条长为 1467bp的 物信息学手段对该 cDNA序列的结构特点进行了分 片段，将获得片段克隆到pMD18一T上，选取多个克 析，还获得 了该 cDNA序列相对应的基因组序列。 隆进行测序。测序 结果表 明，除了扩增得到 结果表明，该青蒿 cDNA序列是一个新的P450序 CYP71AV1序列之外，还得到了1个和 CYP71AV1 列，而且和已经发表的青蒿P450CYP71AV1有很高 同源性很高的P450序列。为验证这个序列的正确 的同源性。 性 ，根据该序列