任务1大肠杆菌染色体DNA的制备.pptVIP

项目 基因工程菌的构建与表达 任务1 大肠杆菌染色体DNA的制备 一、实验目的 了解细菌DNA制备的原理。 掌握细菌DNA小量制备的操作方法。 二、实验原理 细菌总DNA的小量制备过程主要由3步完成： 1. 细胞的制备 培养并收集一定量的细菌细胞。 2. 细胞的裂解 在碱性（pH 9.0）条件下，用强的阴离子去污剂十 二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sufact，SDS）使细菌细胞裂解，并用高浓度NaCl沉淀蛋白质等杂质，再用酚使残余的蛋白质彻底变性。通过离心，细胞碎片及变性蛋白质复合物被沉淀下来，而DNA则留在上清液中。 3. DNA的分离 利用乙醇沉淀溶液中的DNA。为了进一步纯化 DNA，通常用无DNA酶的RNA酶水解溶液中RNA，最终获得纯度较高的细菌DNA制品。所获得的DNA制品可用于分子克隆和其他酶的反应。 三、实验材料 菌种 大肠杆菌DH5α菌株。其相关基因型，supE44△lacU169(Φ80 lacZ△M15) hdsR17 recA1 gyrA96 thi-1 relA1。 上述菌株是一种用于铺制平板培养质粒和hdsR17 recA1 gyrA96 thi-1 relA1黏粒的重组缺陷琥珀抑制型菌株。其中Φ80 lacZ△M15突变可与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补。 三、实验材料 培养基 LB斜面及液体培养基 胰化蛋白胨（bacto-tryptone） 1g 酵母提取物（bacto-yeast extrance） 0.5g NaCl 1g 琼脂 1.5～2g 水 100ml PH7.0 121℃灭菌 20min 三、实验材料 试剂和溶液 溶菌酶溶液（10mg/mL） 1%SDS-0.1mol/L NaCl-0.1mol/L Tris-HCl（pH9.0） 酚：氯仿溶液（1：1，V/V） 95%乙醇，75%乙醇 0.1×SSC溶液（standard saline citrate，标准柠檬酸盐），20×SSC溶液 无DNA酶的RNA酶A（20μg/mL） TE缓冲液（pH8.0） 三、实验材料 仪器和其他物品 超净工作台，台式高速离心机，恒温箱，恒温摇床，恒温水浴等； 微量移液器，无菌的1.5mL Eppendorf微量离心管，吸头，移液管和玻璃试剂瓶等。 四、实验内容 细胞的制备 从活化的大肠杆菌DH5α斜面上挑取少量菌种，接种到1支装有5 mL LB液体培养基的试管中。置于恒温摇床中37℃振荡培养过夜（约16～18h）。 各吸取3份1.5 mL的培养液，分别转移至3支Eppendorf微量离心管中，用台式高速离心机12000r/min离心30s。 离心后，用微量移液器的吸头吸去所有上清液。弃上清液，保留菌体沉淀。 四、实验内容 细胞的裂解 合并3管菌体沉淀，加入15μL溶菌酶（lysozyme）溶液（10mg/mL，即配即用），在37℃恒温水浴中保温15min。 加入125μL1%SDS-0.1mol/L NaCl-0.1mol/L Tris-HCl（pH9.0）溶液，盖上管盖，颠倒离心管数次，使管内的内容物混匀。溶液呈蛋清样，中间出现团状黏性物质。 在上述溶液中加入等体积（150μL）的酚：氯仿溶液，充分振荡。 用台式高速离心机12000r/min离心3min。离心后，吸取上清液，并转移至另一支微量离心管中（上清液中含有DNA）。 四、实验内容 DNA的分离 在装有上清液的微量离心管中，加入二倍体积（300μL）95%乙醇，振荡混匀。在室温下放置2min，或在-20℃放置30min，沉淀DNA。 用台式高速离心机12000r/min离心5min。离心后，吸取所有上清液，保留DNA沉淀。 在DNA沉淀管中加入100μL的0.1×SSC溶液溶解DNA（注意，低盐浓度有利于DNA的溶解）。DNA溶解后，在加入5μL20×SSC溶液。 四、实验内容 在上述DNA溶液中加入50μL无DNA酶的RNA酶（牛胰RNA酶）（20μg/mL），置于37℃恒温水浴中保温30min。 加入等体积的（100μL）酚：氯仿溶液，充分振荡。 用台式高速离心机12000r/min离心3min。离心后，吸取上清液，并转移至另一支微量离心管中。 加入二倍体积95%乙醇，振荡混合。在室温下放置2min，或在-20℃放置30min，沉淀DNA。 用台式高速离心机12000r/min离心5min。离心后，吸去所有上清液，保留DNA沉淀