实验三、质粒DNA的提取.docVIP

实验、质粒DNA的提取一、实验目的 学习和掌握碱裂解法提取质粒学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、实验原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称 CCCDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，（open circular DNA， 简称OCDNA）；线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。 三、主要试剂 溶液Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH 8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0） 溶液 Ⅱ 0.mol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH 母液稀释）， % SDS，用前等体积混合（新鲜配制） 溶液 Ⅲ 5 mol/L 乙酸钾 60 ml 冰乙酸 11.5 ml 水 28.5 ml 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回） RNase 将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成 10 mg／ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。 LB+Amp培养基：LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。Tris 242g 冰乙酸 57.1ml 0.5 mol/L EDTA 100 ml pH 8.0 9. 1%琼脂糖凝胶： 称g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的电泳板上。四、仪器耗材 恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台五、实验步骤 （一）细菌的培养 将含有pUC19质粒的大肠杆菌，在LB+Amp100培养基平皿上划线，获得单菌落。（37℃培养过夜） (二) 质粒提取 将2 mL含Amp（100ug/mL）的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌（单菌落），37℃振荡培养过夜。 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 将细菌沉淀悬浮于100 uL溶液Ⅰ中，充分振荡混匀，室温放置5 min。 加200 uL溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物，将离心管放冰上5 min 。 加入150 uL溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 5 min 。 12000 r/min ，离心15 min ，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积氯仿异戊醇（24:1），反复混匀，10000 r/min，离心10 min，将上清转移到另一离心管中。 向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置15～20min。12000r/min离心 10 min。倒去上