层析、色谱.pptVIP

色层分析法简称层析法，色谱法。分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 一、层析法的由来 色层分析法是1903年由俄国化学家,植物学家茨维特研究用碳酸钙分离植物色素时发现的 .后来采用此方法,亦可用于无色组分的分离.故色谱法只不过是一个延用的名词,并非表示只能分离有色组分. 目前,各种类型的层析法,特别适合于分离不稳定化合物,结构相似,性质相近的化合物,是分离混合物的近代技术 二、构成层析法的条件 色层法应具备的因素或条件是:1. 具有两相2. 混合物中各组分的物理化学性质有差异3. 多次冲洗或展开三、层析法分类1、按两相的物理状态分为 气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。 气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)， 2、按分离机制分为 吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。(此外还有电泳。) 3、按操作形式分为 纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法和反相色谱法 正相色谱法　采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法　一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 ?从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 2、按层析的分离机理分类 （1）排阻层析(exclusion chromatography) 利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。 凝胶装置图 色谱峰和分离结果 葡聚糖凝胶层析原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离 （1）凝胶的种类和性质 1） 交联葡聚糖凝胶（Sephadex) Sephadex G 系列，直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成。 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍(每克干胶溶胀时吸水体积ml的10倍)。 如：Sephadex G25 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。吸水量小的凝胶溶胀达到饱和的时间短，如Sephadex G25须溶胀3h，而Sephadex G100常温下要溶胀3天。孔径大小G25 G100 2）琼脂糖凝胶（Sepharose) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结