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国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点 畜禽饲料中添加使用微生物发酵生产的植酸酶可提高植物性饲料中植酸及其盐的利用率, 减少日粮中磷酸氢钙等磷源的添加量, 降低饲料成本, 目前已经被广泛使用。为了确保实际生产中植酸酶使用效果, 如何准确测定植酸酶产品的酶活性是养殖场、饲料企业和酶制剂生产、经销商所共同关注的问题。 目前, 国内植酸酶产品酶活性测定大多采用国家标准 GB/T 18643—2002《饲料用植酸酶活性的测定分光光度法》。该方法标准中, 包括两种方法: 绝对法和相对法。该测定方法的分析步骤不是很复杂, 所涉及的仪器设备饲料企业的实验室也都有配备, 但要获得准确和重复性好的分析结果也不容易, 需要加强对检测原理和步骤的理解。该方法是基于样品在植酸钠浓度为 5.0 mmol/l、温度 37 ℃、pH 值 5.50 条件下, 每分种从植酸钠中释放 1 μmol 无机磷,即为 1 个植酸酶活性(以 U 表示)的定义基础上测定的。鉴于绝对法应用比较普遍, 现将我们在开展植酸酶产品活性测定过程中一些经验体会总结如下, 供同行们参考。 1 溶液配制 植酸酶活性测定直接所用到的溶液主要有 3 种, 即乙酸缓冲溶液、植酸钠底物溶液和显色终止液。 1.1 乙酸缓冲溶液 国标方法中, 绝对法测定植酸酶产品酶活性所使用 的乙酸缓冲溶液浓度为:c(CH 3 COONa·H 2 O)=0.25 mol/l。 缓冲溶液是确保整个酶反应体系的 pH 值在规定范围 内的关键因素, 必须准确配制。 1.1.1 配制方法 称取 34.02 g 三水乙酸钠,0.1 g 吐温 20 于 1 000 ml 容量瓶中, 加入 900 ml 水溶解, 用乙酸调节 pH 值至 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 《饲料工业》·2008 年第 29 卷第 14 期 检 测 技 术 475.50±0.01, 室温下贮存 2 个月有效。 1.1.2 注意事项 ① 调节配制溶液 pH 值使用的酸度计应该是经 过校准, 且精度为 0.01; 所用复合电极必须在使用寿 命内。建议可以购买标准 pH 值的溶液进行验证。 ② 现行国标方法中用盐酸调节缓冲溶液的 pH 值。尽管文献报道, 用盐酸和乙酸调整 pH 值对酶活 性测定结果没有明显影响, 但考虑到缓冲体系为乙酸 缓冲溶液, 建议最好用乙酸调节 pH 值。 ③ 尽管缓冲溶液在室温下可贮存 2 个月有效, 但贮存期超过 1 个月, 建议重新再确认 pH 值是否有 变化, 如果有变化, 需要重新调节 pH 值。另外贮存期 间容器要密闭。 1.2 植酸钠底物溶液 1.2.1 底物溶液的配制 底物浓度大小直接关系测定酶活性大小。国标 绝对法中植酸钠底物配制浓度为: c(C 6 H 6 O 24 P 6 Na 12 )= 7.5 mmol/l,而实际反应液中浓度为 5.0 mmol/l,即样品管 中酶溶液 2 ml,底物溶液(7.5 mmol/l, 4ml),体系共 6 ml, 底物在该体系中的浓度为 5.0 mmol/l[(4×7.5)/6]。 底物溶液的配制: 准确称取 0.692 9 g 肌醇六磷 酸钠(C 6 H 6 O 24 P 6 Na 12 ) 于 100 ml 容量瓶中, 用乙酸缓冲 溶液溶解并定容至刻度, 用乙酸调节 pH 值至 5.50。 1.2.2 注意事项 ① 选择适宜的植酸钠产品作为底物 目前, 作为底物用的植酸钠有两种型号, 一种是 Sigma p - 3168, 目 前 更 新 为 p - 0109, 分 子 式 为 C 6 H 6 O 24 P 6 Na 12 ·xH 2 O, 相对分子质量为 923.8( 不含水基 础), 另一种是 p- 8810, 分子式为 C 6 H 6 O 24 P 6 ·xNa + · yH 2 O, 相对分子质量为 660.03 (不含水游离酸基础)。 使用 p- 8810 做底物, 样品空白的吸光度较高, 例如标 示 5 000 U/g 活性植酸酶产品, 称样量约 0.2 g, 20 000 倍稀释后, 样品空白吸光度为 0.637, 样品管的吸光度 为 1.207。而同样一个样品使用 p- 0109, 样品空白吸 光度仅为 0.002, 样品管的吸光度为 0.545。但从我们 测定的酶活性结果来看, 前者要略高于后者。建议选 择 p- 0109 作为底物。 ② 底物溶液一定要现用现配。 ③ 注意植酸钠底物溶液 pH 值的调节。植酸钠作 为一种强碱性弱酸盐, 溶解于水后显碱性。尽管植酸 钠底物溶液是用 0.25 mol/l 乙酸缓冲液配制的, 但配 制后溶液的 pH 值不能保持在 5.50。我们实验室配制 完的底物溶液的