棉花黄萎病、枯萎病拮抗细菌筛选及相关抗病基因克隆.pdf

摘 要 棉花黄萎病、枯萎病是目前最主要的真菌病害之一，给世界棉花产业造成严重的经济损失， 且极难防治。因此筛选拮抗菌、克隆抗病相关基因、研制高效生物农药具有十分重要的意义。本 实验从土壤中筛选高效拮抗菌株，克隆细菌源棉花黄萎病、枯萎病的抗病相关基因，为构建基因工 程拮抗菌、制备微生物农药提供技术平台。 从中国农业科学院植物保护研究所黄萎病、枯萎病发病较轻的试验棉田采集根围土，利用土 壤稀释分离法从中分离出21株细菌。通过平板对峙法，筛选出5株具有自主知识产权的，对棉花 黄萎病菌、枯萎病菌皆具有拮抗活性的细菌。这5株拮抗细菌C5，(26，s6，SI，BI的发酵液对 5株拮抗细菌经过革兰氏染色均为阳性细菌。利用16srDNA技术，s6被初步鉴定为芽孢杆 菌。经过在不同培养条件下对S6oDⅫ值的测定发现：s6生长迅速，28℃在LB液体培养基中 2h即达到生长对数期，30h后达到生长展高峰。s6在15～50C范围内均能生长，最适生长温度为 28℃。在pH值4～9之间均能良好生长，最适口H值为7。 s6在Amp、Cm、Ery、Rif、Kin等常见抗生素培养基中不能生长，能耐受25u$／mL浓度的 Spe、Sm。用细胞壁降解酶平板检测，发现s6在果胶酶、几丁质酶、纤维素酶，葡聚糖酶检测培 养基平板上均出现显著水解圈。用DNS等方法测定，s6分泌的几丁质酶、葡聚糖酶、果胶酶、 挥发性的拮抗物质。 葡聚糖酶是重要的一类抗菌酶，具有很高的应用价值。根据己知的葡聚糖酶基因序列设计葡 聚糖酶特异引物，经PCR扩增获得一700bp的条带，经测序及上网比对，该序列与来源于 Bacilluscereus E33L葡聚糖酶基因具有很高的相似性，初步认为该片段为葡聚糖 酶的部分基因片段。为了进一步获得拮抗相关基因，利用转座子piC333构建s6的插入突变体 库，通过影印培养，筛选出3株抗菌活性显著下降的突变株，经过BOX-PeR验证后，从突变株 中获得一500bp的序列，将此序列与GenBank中的序列进行比对，发现该片段与来源于 枯草芽孢杆菌的伊枯草杆菌素合成酶B(iturinAsynthetaseB)基因片段相似性高 达99％，初步认为该序列为伊枯草杆菌素合成酶B基因片段。 关键词 棉花黄萎病 棉花枯萎病 芽孢杆菌 克隆 基因 Abstract CottonVerticilliumandFusaziumwiltsarecolnnloB hardtobe plantdi∞as鼯。and controlled．皿ey callseserious tothewodd is toisolate damage economy．Iturgent the bacteriaand antagonistic develop the tocontrolthediseases．Inthis biologicalpesticides screened5 bacteria research，wo antagonistic whichcarl inhibitVerticilliumwilt andFusarium strongly pathogen wnt thenclonedthe pathogen．and resistance-related gene． 21bacteriawefeIsolatedfromCOttOnland soil fromThePIantProtectionInstituteof rhizosphere Chi