人淋巴细胞和仓鼠成纤维细胞(Wg3h)十五种同工酶的分析方法.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)10(3):37-40198旦 实 验 技 人淋巴细胞和仓鼠成纤维细胞 W（g3h）十五种 术 与 同工 酶 的 分 析 方 法 方 法 徐 芸 邱信芳 （复且大学遗传学研究所，上海） 体细胞的融合技术，正被广泛应用子人类染色体 二（）样品制备 的基因定位一「”‘，杂交瘤细胞的形成和细胞恶变研 收集的细胞悬浮在 Hanks溶液中，计数。分装至 究3「，以及基因表达调控[91和进化的研究10〔1。对于杂 Eppendorf离心管中，每管约，X10‘细胞。离心，去 种细胞的鉴定，分析其中的染色体组成，可以通过细胞 除上清液。沉淀中加入101al细胞抽提液 （最终浓度为 遗传学水平的核型分析和对染色体基因标记酶的测定 5X10/川）。留出一管待用。其余则保存在液氮罐中 来确定。本文报道了在鉴定中国仓鼠和人淋巴细胞形 或-80℃冰箱中。可保存一周左右。 经液氮和37C 成的杂种细胞时，常用的15种同工酶的醋酸纤维素薄 水浴反复冻融细胞。离心，上清液作为电泳样品。 膜电泳的分析方法。 细胞抽提液：1mM EDTA-Na.;1mM,3(-琉基 这 ［5种同工酶是：顺鸟头酸酶 2(A^onitase 乙醇;0.1mA9二异丙基氟磷酸 (di-isopropylfluoropho- (mitochondrial)E.C.4.2.1.3.AC02)；腺苔酸激 sphate.DNP）和 0.02-AI辅酶 I)(NADP)，用 5mM磷 酶 (AdenylateL;inase-1E.C.2.7.，·3.AK1）；腺 酸盐缓冲液 (pH6.劝 配成。 苔脱氨酶 (Adenosinedeaminase.E.C.3.5.4.4.ADA): 三〔）电泳与染色 谷草转氨酶 (Glutamic-oxaloacetictransaminase.E.C. 用醋酸纤维素薄膜电泳 醋（酸纤维素薄膜由上海 2.6.1.1·GOI）；葡萄糖磷酸异构酶 (Glucosephosphate. 湖南化剂室提供）。电泳电压为15V/cm。电泳结束后， isomerase.E.C.5.3.1-，．GPI)；谷眺甘肤还原酶 将醋酸纤维素薄膜取下，酶反应液与等体积2%琼脂 (Glutathionereductase.E.C.1.6.4.2.GSR);葡萄 粉混合 4（5-C)，倒在染色盒内，待凝固后，将醋酸纤维 糖一6一磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphatedehydrogenase. 素薄膜正面朝下，覆盖其上，置于37℃保温。 E.C.1.1.1.49.G6PD)；己糖胺酶 (Hexosaminidase. 各个酶的电泳缓冲液，同工酶显示反应液是： E C.3.2.1·30.HEXB);乳酸脱氢酶 (Lactate 1.AC02 电泳缓冲液： 0.02MNaH,P04，用 dehydrogenase.E.C.1.1.1.27.LDH)；苹果酸脱 NaOH调至 PH7.0。电泳时间为2小时。 氢酶(Malatedehydrogenase.E.C.1.1，1·37.MDH); 染色液：100nmg顺乌头酸，8mg辅酶 11;100AI 苹果酸酶 (Malicenzyme.E.C.1.1.1.40.ME); 异柠檬酸酶 (60u/ml);4-l0.2MMgCl,;3m1唾哇 甘露塘磷酸异构}if-a(Mannosephosphateisomerase.E. 蓝 M（TT,5mg/m1);2ml吩嚓二甲硫酸醋 (pMS, 0.5.3.1.8.MP1);核营磷酸化酶(Nucleosidephospho- 5mg/ml);8ml0.36MTris-HCI缓冲液 p（H8.0), rylase.E.,C.2.4.2.1.NP);磷酸葡糖变位酶 各组份按序加人。染色时间为30分钟。 (Phosphoglucomutase-1.E.C.2.7.5.2.PGMI);队 2.ADA 电泳缓冲液：0.02MTris，用饱和柠 酶 A (Peptidase-A.E.C.3.4.11.PEPA).