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反向遗传操作在牛病毒性腹泻病毒研究上的应用 翁晓刚，朱要宏，王九峰 （中国农业大学动物医学院，北京 100193） 摘要：反向遗传操作系统的建立为RNA病毒的研究提供了一个强大的工具。该技术从上世纪90年代开始被应用于牛病毒性腹泻病毒研究工作，此后该病毒的分子生物学研究取得了长足的进展。本文综述了反向遗传操作在牛病毒性腹泻病毒上的建立过程以及该技术在病毒生物型形成、病毒复制和病毒蛋白功能等研究上的应用及进展。 关键词：牛病毒性腹泻病毒；反向遗传；生物型；病毒复制；病毒蛋白 Application of Reverse Genetic on Bovine Viral Diarrhea Virus Research WENG Xiao-gang, WANG Jiu-feng (College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193) Abstract: The establishment of reverse genetic system provided a powerful tool to RNA virus research. The molecular biology on bovine viral diarrhea virus has achieved significant improvements after the application of reverse genetic in 1990s. This article reviewed the history of the application reverse genetic technology on this virus, and the recent progress on the virus biotypes transformation, virus replication, and functions of viral proteins. Key words: BVDV; reverse genetic; biotypes; virus replication; viral proteins 0 引言 牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）是影响畜牧业发展的重要病原。BVDV可感染牛、羊、鹿以及猪等动物，目前广泛流行并呈全球性分布[1-6]。它可引起动物产生多种临床症状，从轻度腹泻、呼吸道疾病到流产，甚至粘膜病[7]。BVDV能够导致宿主的免疫耐受并形成持续性感染（PI），这也是该病毒能够持续存在并广泛流行的重要因素[8-9]。牛病毒性腹泻病毒属于有囊膜的小型RNA病毒，是黄病毒科瘟病毒属的典型成员。BVDV基因组全长12.3-12.5kb，包含一个大的开放阅读框（Qβ噬菌体感染性克隆并成功完成了首例RNA病毒的拯救[10]。此后，科学家相继在脊髓灰质炎病毒、植物类病毒、流感病毒和呼肠孤病毒等其它RNA病毒上应用了该技术[11-12]。在BVDV所在的黄病毒科中，目前已有多株病毒建立起了反向遗传操作系统。其中包括在1997年由Kolykhalov和Yanagi分别构建成功的HCV感染性克隆[13-14]。BVDV感染性克隆的成功构建离不开前人在其它正链RNA病毒上的建设性工作，特别是该技术在猪瘟病毒上的大量研究应用。1996年，Moormann等第一次用CSFV C株作为参考母本进行分段克隆，最后将片段连接于由低拷贝质粒pOK12改造而来的载体上，随后进行体外转录，最后成功转染并在此基础上得到了多株改造病毒。这是感染性克隆在瘟病毒属上的首次成功构建[15]。不久后，Ruggli和Meyers等也使用类似方法得到CSFV的改造病毒并得到缺陷干扰粒子[16-17]。同年，Meyers等基于猪瘟病毒的研究基础，第一次成功拯救出BVDV CP7毒株。作者参考了三株CSFV毒株的感染性克隆构建策略和方法，并在此基础上完成了对BVDV的拯救。作者使用了pACYC177低拷贝质粒作为全长cDNA的载体，构建出包含T7启动子的全长cDNA后于体外完成转录，然后将MDBK作为受体细胞，转染后利用了蚀斑实验、Northern blot和RT-PCR检测拯救病毒。然而由于当时技术水平的限制，他们获得的拯救病毒并不是源于CP7的准确基因组，主要原因是没有获得病毒基因组两端的准确序列。他们使用了其它毒株的UTR克隆片段与CP7的部分片段连接，在此基础上构建了感染性克隆[18]。随后，Rice等人为了研究病毒NS2区碱基的插入与致细胞病变的关系而尝试构建该病毒的感染性克隆，他们选择了将NADL株作为构建母本。起初，研究人员在构建过