甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留蛋白含量检测方法的研究论文.pdfVIP

甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)中Veto细胞残留蛋白含量检测方 法的研究 曹雨露，胡艳灵，黄明，王益民，蒋建江，周佳丽，陈明曦， 孙玲华，张玉慧，陈统球 (江苏延申生物科技股份有限公司，江苏常州213018) 【摘要】建立甲型肝炎灭活疫苗制品中Vero细胞残留蛋白含量测定方法．制备Vero细胞蛋 白抗原，免疫家兔制备抗血清，提取纯化抗血清IgG并以酶标记，建立酶联免疫吸附法检测 系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线，并对各项指标进行验证。结果显示 兔抗IgG效价为1：32，通过Westernblot表明兔抗IgG与Vero细胞蛋白抗原能特异性结合； 通过方阵试验确定抗体包被浓度为1：400，酶标抗体工作浓度为1：200‘--1：400，抗原 r=O．995，该试剂特异性、精密度及 参考品检测范围为25800ng／ml，线性关系良好， 准确度良好，稳定性试验证明在4℃可保存半年。建立了酶联免疫吸附法，可用于甲型肝炎 灭活疫苗中Vero细胞残留蛋白含量的检测。 【关键词】甲型肝炎灭活疫苗；Vero细胞残留蛋白；酶联免疫吸附法 Vem细胞是生物制品生产主要的细胞基质，由于具有传代细胞特性，因此 也存在理论上的潜在致肿瘤性(1)，通过控制宿主细胞残余蛋白含量(HCP)可以 降低该风险，因此HCP含量的检测越来越受到人们的关注。韩国学者Kim Hyun Su等(2)首先报导了检测Vero细胞制备的乙型脑炎减毒活疫苗中HCP残留含量 方法，日本学者Keishin Sugawara等(3)使用酶联间接双抗体夹心法检测Veto细 胞生产的乙型脑炎灭活疫苗中HCP含量，田博等(4)报导建立间接酶联免疫法， 但重复性差敏感度低，王辉等(5)报导建立了酶联双抗体夹心法检测Vcro细胞残 留蛋白含量。 本文研究建立了甲型肝炎灭活疫苗制品中Vcro细胞残留含量的检测方法一 酶联免疫吸附法，将用以今后疫苗制品的检定，对控制疫苗制品的质量，保证 接种者的安全具有及其重要的意义。 1材料和方法 1．1 Vero细胞蛋白抗原的制备 采用与疫苗生产工艺相同的方法培养Vcro细胞，弃细胞上清，消化细胞，通过 作者简介：lit雨露，男，1983年生，江苏扬州人，本科，主要从事儡毒性疫苗的研发工作． E-Maill cyll2000@163．CON Veto细胞蛋白。采用Lowry法和BCA法测定蛋白含量。 1．2抗Vero细胞蛋白血清的制备 将细胞蛋白与完全弗氏佐剂各5ml充分摇匀包溶后，免疫两只家兔，在兔 大腿肌肉和背部皮下各注射5ml作为基础免疫，然后于免疫后d14、21和34 用5mlVero细胞蛋白腹腔加强免疫3次，末次免疫l周后采血用双向扩散法测 A．50 定血清效价，达到l：32时颈动脉放血，分离血清，采用DEAE．Sephadex blot 纯化得到lgG提纯液。用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，通过Western 法检测抗体特异性。 1．3 ELISA方法的条件摸索 采用方阵试验确定包被抗体及酶标抗体的工作浓度，并对包被液、封闭条 件、反应时间等进行优化，确定最佳条件。 1．4绘制抗原定量标准曲线 将Vero细胞蛋白抗原参考品以2倍系列稀释，测定各浓度的A450值，经 直线回归方程计算选择最佳的线性回归范围，作为定量检测的标准曲线。 1．5方法验证 根据中国药典对检测方法验证要求，对试剂进行了准确性、精密度、特异 性和稳定性验证。 2结果 2．1 两批Vero细胞抗原蛋白参比品的制备 蛋白由多种不同蛋白条带组成，必从14400～57000。 2．2兔抗IgG抗体的双向扩散及Westernblot检测 通过双向扩散试验，抗体效价为l：32。提纯抗体与Veto细胞蛋白抗原进 行Westernblot，结果见图l，可以看出抗体与抗原