第25章病毒感染的检查方法.docVIP

第25章 病毒感染的检查方法 与防治原则 病毒的诊断 随着对病毒感染从生物学及分子生物学水平的研究进展，病毒的诊断技术已由传统方法扩展至新的快速诊断技术。病毒感染的快速诊断有利于对病毒感染者的治疗；例如对有些病毒（如疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒）感染已有较特异的抗病毒药物治疗。早期诊断及早期治疗对控制病毒感染十分重要。此外，从群体感染角度分析，确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学（如新型流感病毒、肺出血型汉坦病毒的发现等）方面也有重要的现实意义。 标本的采集与送检 用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。血清抗体检测标本应保存于－20℃。 病毒的分离、培养与鉴定 目前最常用的方法是细胞培养。在注明欲检测的病毒后，病毒分离培养的实验室将选择适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。如我国台湾省确定由肠道病毒71型引起多数患儿发生脑膜炎并致死的研究报道，就是由分离培养及鉴定病毒所确诊。如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的机率。再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。 在流感病毒的分离培养中，最敏感而特异的方法是鸡胚接种，并用血凝和血凝抑制试验以鉴定病毒。此外，细胞培养也可应用。分离流感病毒在发现新变异株中具有重要价值。接种动物分离病毒的方法目前已很少应用，但对狂犬病病毒及乙型脑炎病毒的分离与鉴定中还需应用动物接种，并结合用特异抗体作中和试验或作免疫荧光染色以鉴定病毒种类。 检测病毒抗原及抗体方法 对于一些血清型别不多的病毒或在寻常细胞培养系统中还不能成功增殖的病毒，直接检测抗原是快速而实用的方法。这一方法要求标本中有一定量的抗原和具备高质量的抗体；其原则为免疫学技术，即用特异标记的抗体检测相应的抗原。可以用免疫荧光或免疫酶标记抗体检测在病毒感染局部脱落细胞或分泌物细胞中的抗原，也可用酶联免疫测定法（ELISA）或乳胶凝集法检测抗原。这一方法在数小时或一天内可获得结果。 用特异的抗原可以检测病毒感染者血清中的IgM抗体，以快速诊断病原体。应用的病毒抗原或是利用基因工程表达的重组抗原，也可以是用根据编码基因片段推导的合成肽作为抗原。一般多用ELISA法检测。由于IgM抗体出现于病毒感染早期，标本采集的时间对这一方法的检测结果影响很大。此外，所用抗原的质量与覆盖抗原表位的幅度也会影响检测结果。用特异抗原也可检测IgG类抗体，但IgG抗体类型用于临床诊断则必须具有早期与恢复期双份血清，并且抗体的效价需有4倍或以上的升高或降低方有诊断价值。在有些病毒感染中，如获得的血清标本已属感染后期，也可在随访中测定抗体效价，如有4倍降低，可作出辅助诊断。IgG抗体的检测在调查某一病毒感染在某些地区人群中的感 染率也有价值。此外，还可将病毒蛋白先经凝胶电泳，再转移至膜上，用血清标本与之作用后染色的方法（称Western印迹法、免疫印迹法或蛋白印迹法）检测血清中针对某种病毒抗原亚单位的抗体。例如这一方法已用于确诊病人所产生的HIV抗体等。 检测病毒核酸的方法 由于多数病毒基因均已成功地被克隆及进行了核苷酸序列测定，因此可以利用病毒基因作为探针，用核酸杂交的方法检测标本中有无相应的病毒核酸。作为探针的病毒核酸可以用同位素或非放射性核素标记。用探针杂交后，为检测核酸杂交体，可用放射自显影法或用生物素－亲和素系统进行检测。这一方法的敏感性一般并不高，但对标本中含有病毒核酸量较多时则很实用。用凝胶电泳将标本中DNA电泳后，转移至膜上（Southen印迹法），再用病毒探针作核酸杂交，可根据分子量大小分辨标本中病毒核酸存在的状态，例如是整合型还是游离型。 对于已测定基因核苷酸序列的病毒，可设计相应的病毒基因的引物，作多聚酶链反应（PCR）。其原则为先加入标本中提取的核酸（根据待测病毒为RN