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正常细胞培养正常细胞培养 上皮细胞培养 • 上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能 成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受 到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时 生长速度往往超过上皮细胞生长速度往往超过上皮细胞，，并难以纯化并难以纯化，，同时上皮细胞同时上皮细胞 难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关 键。 • 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原 的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以 3T3细胞为饲养层 （用射线照射后）时，细胞易生长并可 发生一定程度的分化现象发生一定程度的分化现象。。降低降低PHPH 、、Ca2+Ca2+含量和温度含量和温度，， 向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。 • 以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞， 其法如下 • 1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取 角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。 2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。 3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。 44、、分离分离：：取出皮块取出皮块，，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。。 5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30— 60分 钟。 6、反复吹打，制成悬液。 7、培养：用80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。 8、直接加入培养基 （Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入 培养瓶，CO2温箱培养。 巨噬细胞培养 • 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、 细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得， 便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在 条件适宜下可生活22 －33周，多用做原代培养，难以长期生 存。 • 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331 、 S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞 形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以 小鼠腹腔取材法最为实用小鼠腹腔取材法最为实用，，其法如下其法如下：： • 1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml （勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。 2、引颈处死小鼠。 3 、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3 －5秒。 44、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮 肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜 壁。 5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入 腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内 流动。 • 6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中 于针头下吸取入针管内。 7、小心拔出针头，把液体注入离心管。 8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养 基。 9、计数细胞。每只鼠可产生20一30 ×106细胞，其中90% 为巨噬细胞为巨噬细胞。。 10、以3 ×105个贴附细胞/平方厘米接种。 11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯 化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液 置CO2温箱中。 非特异性酯酶染色 小鼠腹腔巨噬细胞鉴定 原代胚胎成纤维细胞培养 实验器材： 手术小直剪刀三把 眼科直镊子三把 眼科弯镊子两把 玻璃平皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管 和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。 实验试剂： 无Ca+2和Mg+2 的PBS 0.05%胰酶0.53mmol/L EDTAEDTA溶液溶液 小鼠胚成纤维细胞 （MEF ）生长培养基:高糖DMEM加 10%FCS。 • 实验动物：孕期14至16天的孕鼠 实验步骤 • 1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中 用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀 和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和 镊子将子宫小心取出放在盛有PBSPBS 的玻璃平皿中，冲洗去 血。 • 2.用两把弯镊