纤维连接蛋白EDA、EDB片段在人体皮肤切创表达及其重组蛋白制备.pdfVIP

2002牟童里太学压学悲顾t柳宓硅半0话立 纤维连接蛋白EDA、EDB片段在人体皮肤切创的表达 及其重组蛋白的制备 中文摘要 纤维连接蛋白在三个部位发生可变剪接，分别是EDA、EDB和IlICS(在大 表达量均随时间延长而逐渐增大。为进一步明确人体皮肤切创纤维连接蛋白可变 剪接片段EDA、EDB基因表达与损伤时间的关系，我们制备地高辛标记反意RNA 探针，在人体切创皮肤标本组织上进行原位杂交，观察人体切创皮肤标本切创边 缘细胞的FN—EDA、EDB mRNA表达情况与创伤时间的关系：在此基础上，我 们构建融合了EDA、EDB基因片段的质粒，然后用原核细胞表达蛋白质，经过 纯化、检测。获得重组融合EDA--EDB蛋白，为下一步制备抗体，通过免疫组 化检测EDA及EDB蛋白质推测早期损伤时间打下基础。 一、cFN可变剪接片段(EDA、EDB)在人体皮肤切创伤后不同时间的表达 ／在人体皮肤切创不同损伤时间段皮肤石蜡切片上，用地高辛标记反意RNA 探钎进行原位杂交。EDA、EDB探针组在正常皮肤均呈阴性反应，皮肤损伤后， EDA、EDB探针组表皮基底层细胞胞浆逐渐出现棕黄色阳性染色，与此相比较， 死后伤皮肤呈阴性反应，据此可进行生前、死后伤的区别。随创伤时间的延长， 各探针组阳性染色亦随之加深；其中EDAmRNA的表达较EDBmRNA出现早， 表达量更高。这些结果提示在皮肤创伤早期cFN的主要分泌细胞为表皮基底细 胞。表皮基底细胞中FN．EDA、EDBraRNA的表达与损伤时间的关系可为早期 损伤时间推断提供一个较为灵敏、特异的参考指标。尤其是EDA更为符合实际 应用o、一一 二、重组纤维连接蛋白EDA—EDB融合蛋白的制备 28a—EDA-EDB质粒， EDB基因片段，酶切后连接EDA、EDB基因片段，构建pET 利用原核细胞表达融合蛋白，获得重组EDA—EDB融合蛋白，并进行纯化检测。重 组pET28a—EDA-EDB质粒成功后将便于大量扩增EDA—EDBDNA，可以制各RNA或 损伤时间的推测也有很大的帮助。获得这个质粒后，进行了重组蛋白的表达，蛋 白纯化后可以免疫动物(如家兔)。制备抗EDA—EDB的多抗和单抗，从而可以检 测EDA—EDB的蛋白表达，用于推断损伤时间及其他功能研究。、+ 关键词：纤维连接蛋白可变剪接片段早期损伤时间原位杂交重组蛋白 、 、 、 k 、 2002年复里太学压亏院硕士研壳4华址铯之 ofFibronectin EDA＼EDB AhernativelySegment Expression Splicing Protein Woundand ofRecombinant lncised nItunlanSkin Preparation Abstract canbe inthree TVl)eIIIfibronectin sites，called alternativelyspliced EDA(EIllA)