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动物细胞培养常用技术 动物细胞培养 中山大学实验动物中心 前 言 1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。 1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。 由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（Gey，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。 组织培养中热门的研究领域 1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢； 2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等； 3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用； 4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。 组织培养的分类及基本概念 分类: 1.组织培养(Tissue Culture) 指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 2.细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群。 3.器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。 组织培养的细胞生物学特点: 1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。 2.细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。 培养细胞的分化 细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。 不适应（Deadaption） 细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。 脱分化（去分化）（Dedifferentiation） 由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力丧失，并很难再现。 不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。 培养细胞的形态 1.贴附型： 1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等 2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等 3）游走型细胞：神经胶质细胞 4）多形型细胞：神经组织细胞 2.悬浮型：如癌细胞 培养细胞的生长和增殖 1.原代培养（Primary Culture）阶段：或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1~4w 2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培养。也就是细胞系（Cell line）阶段，细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。 3.衰退阶段： 自发性转化（Spontaneous Transformation）：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）: 细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite cell line)或连续细胞系(Continuous cell line)。 如：BHK（仓鼠肾成纤维细胞），F9（小鼠胚胎癌细胞），M2R（黑色素瘤细胞）等。 培养细胞的传代培养 当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。 所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。 细胞传代的三个阶段 1）潜伏期（Latent phase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。 二倍体细胞该期时间长（24~96h）； 连续细胞系时间短（10~30min）。 2) 指数生长期（Logarthmic growth phase）： 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。 指数生长期是细胞活力最好的