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实验23 Folin—Wu法测定血液葡萄糖含量 一、目的 学会用Folin—Wu法测定血液中葡萄糖含量。 二、原理 葡萄糖的半缩醛羟基具有还原性，在加热条件下可使碱性铜试剂中的Cu2+还原为黄色的氧化亚铜沉淀，而其本身被氧化为羧基。氧化亚铜可使磷钼酸还原成蓝色的钼蓝，蓝色的深度与葡萄糖的浓度成正比，故可用比色法测定钼蓝的光吸收值来测定葡萄糖的浓度。 3Cu2O + 2MoO3 → 6CuO + Mo2O3 (氧化亚铜) （钼蓝） 血糖即指血液中存在的葡萄糖。由于血液中成分复杂，尤其有许多种蛋白质存在，它们对血糖的测定会产生干扰。因此，目前常用钨酸法处理抗凝血来制备无蛋白滤液，然后用来测定无蛋白滤液中的葡萄糖含量。 Na2WO4 + H2SO4 → H2WO4 + Na2SO4 (钨酸钠) （钨酸） 在测定过程中，由于空气中的氧对Cu2O会产生再氧化作用从而影响测定结果，因此实验中要采用特制的福林—吴宪血糖管——有一细颈，可以尽量减少与空气的接触。（图23-1） 1 2 图23-1 血糖管和奥氏吸管 1．（Folin-吴宪式）血糖管 2.奥氏吸管 三、材料、试剂和器具 （一）材料 饥饿16小时的鸡或兔 （二）试剂 1、草酸钾（A.R） 2、0.25%苯甲酸溶液 3、10%钨酸钠溶液 称取10g钨酸钠，用双蒸水溶解后定容至100ml。 4、1/3mol/L硫酸溶液 5、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） 称取1.000g无水葡萄糖，用苯甲酸水溶液溶解后定容至1000ml，其浓度为1mg/ml。可长期保存使用。使用时用蒸馏水稀释，配成0.1mg/ml的葡萄糖溶液。 6、碱性铜试剂 分别称取40g无水碳酸钠、7.5g酒石酸、4.5g硫酸铜结晶，用蒸馏水溶解后混合，定容至1000ml。本试剂于室温下可长期保存使用，若有沉淀产生，应过滤后再使用。 7、磷钼酸试剂 称取70g钼酸、10g钨酸钠，量取10%氢氧化钠400ml及蒸馏水400ml，于烧杯中混合加热20~40min（以除去可能夹杂于钼酸中的氨），冷却后加入85%磷酸250ml，混匀后定溶至1000ml.. （三）器具 1、剪刀 2、烧杯 3、试管与试管架 4、玻璃棒 5、奥氏吸量管（见图23—1） 6、血糖管（见图23—1） 7、小漏斗 8、可见光分光光度计 9、水浴锅 10、移液管 11、电炉 12、天平 13、容量瓶 四、操作步骤 （一）制备无蛋白滤液 1．杀鸡取血后立即按2g草酸钾/L血液的比例加入草酸钾，以制备抗凝血。 2．于一支试管中加入7.5ml蒸馏水。 3．用奥氏吸管量取0.5ml抗凝血。小心擦去管外血液后，于试管底部缓缓放出血液。吸取试管内蒸馏水吹洗吸管数次后，充分摇匀，使血液完全溶血。注意不要使血液粘附于奥氏吸量管壁。 4．加入1/3mol/L硫酸1ml边加边摇，摇匀后放置5min。 5．加入10%钨酸钠溶液1ml，边加边摇，摇匀后放置5min. 6．过滤、收集滤液备用。若滤液不清，应重新过滤直至滤液澄清为止。至此，所制得的无蛋白滤液为20倍稀释的无蛋白血滤液，即每毫升血液相当于含血0.05ml.. (二)血糖的测定 取血糖管3支，按下表进行编号后操作。 血糖管编号 试剂（ml） 空白管 标准管 测定管 蒸馏水 2.0 无蛋白血滤液 2.0 标准葡萄糖液 2.0 碱性铜溶液 2.0 2.0 2.0 混匀，沸水浴中煮8min，勿摇动取出，流水冷却 磷钼酸试剂 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 19.0 19.0 19.0 2.充分混匀。 3．用分光光度比色测定吸光值A620nm。 （三）血糖浓度计算结果如下： 每100ml血液所含葡萄糖的毫克数=×标准葡萄糖的毫克数× 式中0.1表示2ml血滤液相当于0.1ml血液。 五、注意事项 过滤时应于漏斗上盖一表面皿，防止水分蒸发。 所用试管、漏斗均需干燥。 六、实验报告 以你的实验结果与其它测定血糖方法比较，有什么优缺点？ 七、思考题 1．钨酸的作用是什么？ 2．血糖管和奥氏吸管的结构特点对本实验有何作用？ 3、为什么实验中以无蛋白滤液，而不以全血、血浆或血清来测定血糖含量？