蛋白质突变体基因库构建方法研究进展.pdfVIP

中国生物工程杂志 　Ch ina B iotechno logy, 2006, 26 ( 10) : 52 ～58 综 　　述 蛋白质突变体基因库构建方法的研究进展 张秀艳 　何国庆2 ( 1 华中农业大学食品化学与分子生物学系 　武汉 　430070　2 浙江大学食品科学与营养系 　杭州 　3 10029) 摘要 　体外定向进化是蛋白质工程中一个非常有效的设计策略 。最近几年 ,在过去常用的寡核 苷酸介导的随机突变 、易错 PCR 和 DNA 改组等方法的基础上又出现了一些新的定向进化方法 。 对这些方法及其特点加以总结 ,可为解决特定问题选取相应方法提供一定依据 。最近研究表明: 定向进化和理性设计相结合 、定向进化和以结构为基础的计算设计方法相结合正成为蛋白质工 程中两个新的发展方向。 关键词 　定向进化 　基因文库 　蛋白质工程 　计算设计方法 　理性设计 中图分类号 　Q 814 　　定向进化是在试管内完成高分子的达尔文进化过 1. 1　以寡核苷酸为基础 的最大随机化过程 ( M AX 程 ,为改变酶的底物特异性和催化活性提供了强有力 random iza tion ) 的手段 。它不需要了解酶结构和功能等方面的信息 , 　　该方法的目的是消除传统随机突变技术中产生的 通过对基因的多轮突变和重组来创造突变库 , 再利用 ( 冗余密码子 。它先利用大肠杆菌偏爱的密码子 MAX 高通量的筛选手段从成千上万的突变后代中鉴定出性 ) 密码子 合成一系列突变盒作为选择性寡核苷酸 ,这些 能改善的突变体 [ 1 ] 。近 20 年 , DNA 改组技术的应用使 密码子包括 : GCG (A ) , TGC ( C ) , GA T ( D ) , GAA 定向进化得到进一步的发展 。最近几年 , 构建多样性 ( E) , TTT ( F) , GGC ( G) , CA T ( H ) , A TT ( I) , AAA 突变文库的方法在不断增加 ,这样使产生一个多样性 ( K) , CTG (L ) , A TG (M ) , AAC (N ) , CCG ( P) , CA G 较好 、偏爱性较弱的突变体库变得简单 。另外 ,越来越 (Q ) , CGC ( R ) , A GC ( S) , ACC ( T) , GTG (V ) , TGG 精确的计算预测模型为定向进化实验的设计和分析提 (W ) 和 TA T ( Y) ,再利用 NNN , NN G/ T合成系列寡核 供了有价值的参考 。 苷酸模板 。通过二者之间的杂交选出与选择性寡核苷 　　本文重点总结了新近出现的各种定向进化方法 , 酸互补的模板链 ,通过 PCR 扩增杂交的选择性寡核苷 讨论了这些方法的特点和发展趋势 , 为更好地改造特 [ 2 ] 酸链 ,进行酶切和克隆 。模板寡核苷酸包含了用传 定蛋白质提供了依据 。 统随机突变方法产生的 3 个密码子 ,这 3 个突变密码子 1　多样性基因文库构建方法 之间的不变区与相应的选择性寡核苷酸的不变区互 补 。在杂交混合物中还有两个单一恒定的寡核苷酸以 　　寡核苷酸介导的随机突变 、易错 PCR 和体外重组