已知基因序列获取策略——兼谈引物及设计与序列分析.pdfVIP

生物秀—专心做生物【 】 易生物—实验室问题解决伙伴【 】 已知基因序列的获取策略 兼谈引物设计与序列分析 黄钢 第三军医大学遗传教研室 2006.11.1. 生物秀论坛—学术交流、资源共享、互助社区【/bbs 】 生物秀下载频道【/soft 】 生物秀—专心做生物【 】 易生物—实验室问题解决伙伴【 】 获取序列信息，设计合适的引物 选取相应的组织或细胞，提取RNA并RT RNase H消化（可选） PCR扩增获得全长cDNA 装入合适的克隆或表达载体，菌落PCR、酶切 与测序证实 根据需要进一步进行亚克隆 生物秀论坛—学术交流、资源共享、互助社区【/bbs 】 生物秀下载频道【/soft 】 生物秀—专心做生物【 】 易生物—实验室问题解决伙伴【 】 一、如何获取已知目的基因的 序列信息 n 先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码 产物的基本情况与功能 （） n 进一步查找其核酸相关序列信息，常用 数据库：Genebank、EBI、DDBJ 生物秀论坛—学术交流、资源共享、互助社区【/bbs 】 生物秀下载频道【/soft 】 生物秀—专心做生物【 】 易生物—实验室问题解决伙伴【 】 生物秀论坛—学术交流、资源共享、互助社区【/bbs 】 生物秀下载频道【/soft 】 生物秀—专心做生物【 】 易生物—实验室问题解决伙伴【 】 生物秀论坛—学术交流、资源共享、互助社区【/bbs 】 生物秀下载频道【/soft 】 生物秀—专心做生物【 】 易生物—实验室问题解决伙伴【 】 二、目的基因cDNA序列的获取 方法 n cDNA文库扫描 n RT-PCR n 人工合成 生物秀论坛—学术交流、资源共享、互助社区【/bbs 】 生物秀下载频道【/soft 】 生物秀—专心做生物【 】 易生物—实验室问题解决伙伴【 】 组织RNA的提取 n 在匀浆器中加工冷冻的组织 n 通过注射器加工冷冻的组织 n 在液氮中将组织研磨成粉末 n 在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解 更完全，产量比前二者多一倍。 n 合适的RNA提取方法加上合适的组织处 理方法，才能够获得最佳的提取效果 生物秀论坛—学术交流、资源共享、互助社区【/bbs 】 生物秀下载频道【/soft 】 生物秀—专心做生物【 】 易生物—实验室问题解决伙伴【 】 RNA提取两要素 n 忌讳贪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上 组织，一般50mg用1mlTrizol较合适 n 速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬 Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的 话，可以立即加入氯仿，立即离心，14000r